乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法和应用

摘要：

本发明涉及乙酰乳酸合成酶（ＡＬＳ酶）抑制剂筛选方法和应用。被筛选物参与试管中的ＡＬＳ酶的酶促反应，如果它是该酶抑制剂，则反应速率下降，产物减少，通过测定反应产物的转化物，快速准确地得出酶的活性和化合物的抑制活性，从而实现ＡＬＳ酶抑制剂的筛选。提出了新的空白概念和最佳的pH范围，建立了四种溶剂体系，可溶解各类送检样本，检测了各类化合物及其衍生物，发现了开发高效除草剂的先导化合物，给出了ＡＬＳ酶抑制中浓度ＩＣ₅₀值。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN95109823.3

申请日期：1995-08-29

公开/公告号：CN1119214

公开/公告日：1996-03-27

主分类号：C12Q1/25

申请/专利权人:中国科学院化工冶金研究所

发明/设计人:曹殿芳; 周家驹; 骆元章

主申请人地址:100080北京市中关村北二条1号

专利代理机构:水利电力专利事务所

代理人:王成华

国别省市代码:北京;11

权利要求：

1．乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于：选用乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂，酶促反应的反应物由缓冲液、底物和辅酶配制而成，反应过程表达为：测定反应体系中不含被筛选物的酶促反应速率VO和反应体系中加入被筛选物后的酶促反应速率V1，根据二者比值，确定抑制活性百分数i％，其公式为：反应速率V可用测定酶活即随时间而变化的产物的增加量代表，用E表示，则公式（l）成为：根据测定的E值，计算出被筛选物的抑制活性i％，根据抑制活性i％判断是否为抑制剂及抑制剂的优劣，就可筛选出抑制剂，其筛选过程包括以下步骤：（1）．首先选用比活值5—12μm／mg·hr，体积为0．2—0．5ml的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂；（2）．确定能完全溶解被筛选物的一种溶剂，并配制成浓度为2mg／ml的溶液；（3）．确定进行酶促反应的反应物所含缓冲液、底物和辅酶的组成及在反应体系中的浓度如下：缓冲液：磷酸氢二钾K2HPO4 20mM底物：丙酮酸钠CH3·CO·COOH 15．smM辅酶：氯化镁MgCl2 0．4mM硫胺素焦磷酸 TPP 0．4mM黄素腺嘌呤双核苷酸FAD 8μM（4）．在四个试管中，分别先加入O．5ml的酶和0．6ml 20mM的K2HPO4，再按以下四种情况（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）加入或不加入溶剂，被筛选物溶液，反应物及适量的H2O，配制成2．6ml的反应溶液体系，该体系的PH值为6．9—7．5，在常压，39—40℃，进行l小时酶促反应，生成产物乙酰乳酸，表达式如下：按以下四种情况分别测出产物量E值：