一种用基因工程方法培育的抗黄瓜花叶病毒病甜椒
通过土壤脓杆菌侵染的方法，将基因转化进入甜椒的子叶、真叶、下胚轴，用含ＧＵＳ基因和ＣＭＶ外壳蛋白基因的土壤脓杆菌转化苗龄为１０—１５天的子叶，用含Ｋａｎａｍｙｃｉｎ的芽诱导培养基进行筛选、培养，转化子叶分化出新芽和新根。在抗性芽中检测到ＧＵＳ基因的稳定表达，在转化后的再生小植株中检测到ＣＭＶ外壳蛋白基因整合到植物基因组中；将所得甜椒植株转入大田，得到转基因抗ＣＭＶ甜椒支系。
发明专利
CN95102802.2
1995-03-29
CN1120586
1996-04-17
C12N15/31
北京大学
陈章良
100871北京市海淀区中关村北京大学
北京大学专利事务所
孙博宁
北京;11
一种用基因工程方法培育的抗黄瓜花叶病毒病甜椒，其特征在于所述方法包括：黄瓜花叶病外壳蛋白基因的cDHA克隆和全序列测定和比较；甜椒的离体再生和基因转化；甜椒的离体再生株的获得；1）黄瓜花叶病外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定和比较a．材料与方法cDNA合成试剂盒、DNA序列分析试剂盒均购自Promega公司，α－32P－dNTP为Amersham产品，限制性内切酶等生化制剂购自华美公司；病毒及其RNA的提取从山东大田的发病烟叶中，以改进的Peden等人的方法提取病毒，即用聚乙二醇6000沉淀植物组织抽提液，经差速离心、超速离心和蔗糖密度梯度离心（10－40％）后，得到提纯的病毒。将病毒液用蛋白酶K消化，苯酚氯仿（1：1）抽提，乙醇沉淀，得到病毒RNA；cDNA合成和克隆人工合成一段含24个核苷酸的DNA序列作为引物：5’—TGGTCTCCTTATG GA GAACCTGTG—3’，该引物由北京大学生物系生命中心ABI DNA合成仪合成，可以与CMV RNA 1－4的3’端互扑， cDNA的合成是以CMV的总RNA为模板，用Gubler和Hoffman报道的方法进行的；双链cDNA用T4 DNA聚合酶进行未端补平，将质粒Bluescript用EcoRV切开作为载体，用T4 DN A连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5细胞中，转化菌经筛选后，挑出其中的白色菌落进行分析；筛选和鉴定重组质粒CMV外壳蛋白基因中有一个EcoRI位点，DNA序列分析将全长的cDNA克隆用多种限制性内切酶切开，并亚克隆在Bluescript载体上，以双脱氧核苷酸链终止法，直接用双链DNA测定其cDNA序列，即先将超螺旋的质粒DNA在0．2 mol／L NaOH中变性5min，再以0．4倍体积的5mol／L NH4Ac中和，乙醇沉淀，变性的质粒和序列引物一起退火，然后按Chen和Seeburg的方法测定DNA序列；b．结果：cDNA的合成：在合成cDNA的第一链和第二链时，都加入了α-32P－dATP，经碱性胶电泳后，得到放射自显影的X光片，最长的cDNA片段可达3kb，而CMV RNA基因组在1．0＝3．4kb范围内，从合成的cDNA中获得外壳蛋白基因的完整序列；重组质粒的筛选和鉴定结果如下： cDNA经连接转化后，得到900多个白色菌落，经小链提取质粒，EcoRI酶切分析后，得到21个阳性克隆，插入片段在0．5－2． 0kb之间，对其中的一个质粒pH210的插入片段进行了部分DNA序列分析，发现与发表的CMVD株系的外壳蛋白基因序列吻合良好；pHC210质粒插入片段的完整序列分析及与其它株系间外壳蛋自基因同源性的比较结果如下：经酶切测定， pHC210质粒的插入片段约有1kb，为了测定其完整序列，分析了这段DNA的物理图谱并进而做了不同酶切片段的亚克隆，这段DNA的限制性内切酶位点是：Sa2（0．1kb），EcoR1（0；35kb），Hind3（0． 36kb）， Xho 1（0． 63kb）， Sa2（0． 66kb），其中EcoR1（0．35kb）和Sa2（0．66kb）是CMV－D的相应序列中所没有的，其它位点和CMV－D一致，DNA序列分析的结果证实了这一点；通过对pHC210质粒插入片段的四种亚克隆的DNA序列分析，得到了该质粒完整插片段的序列，经与CMV－D的外壳蛋白基因比较，发现该质粒中含有完整的CMV外壳蛋白基因，该片段全长1008bp，5’端非区654bP，这段1008bp序列与CMV-D的相应序列相比，同源率为92．6％，其中基因编码区的同源率为93．9％，与CMV-Q的相应序列相比，同源序列占73．1％，基因编码区的同源序列占77．1％，由这段序列推知该基因编码的蛋白含218个氨基酸残基，分子量为24060，与CMV-D外壳蛋白所含氨基酸残基数相等，分子量也很接近（后者分子量为24100），序列同源率为96．3％，CMV－Q外壳蛋白含有较多的氨基酸残基（236个），相比之下，二者的同源氨基酸序列占71．5％；根据血清学反应和核酸序列同源性的比较可以将CMV的绝大部分株系分为两个亚组， CMV－Q、CMV－R、CMV－S等属于一个亚组， CMV－D、CMV－C、CMV－Ma等属于另一个亚组，上述cDN A序列同源性比较表明，流行于我国的这种CMV株系应属于CMV－D所在的亚组；2）甜椒的离体再生和基因转化：植物材料：种子消毒方法：清水浸泡半小时，70％酒精消毒30秒，10％次氯酸钠溶液浸泡30分钟，再用无菌水漂洗3－4次；消毒后的种子置于1／2MS固体培养基上，于25℃的光照培养箱中培养成无菌苗，分别取5天，15天，30天苗龄的子叶，10天苗龄的下胚轴， 30天苗龄的真叶为外植体进行培养和转化；植物的组织培养：在超净工作台内将外植体取出接种于培养基上，基本培养基为MS＋3％蔗糖。在此基础上分别加不同种类及浓度的激素，以诱发不同的外植体器官的发生；细菌菌株和质粒：供试菌种：R1000PBI：带有GUS和NPT－2基因，属双元载体系统；系统，其中黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因是从我实验室在山东大田发病烟草中分离出的病毒中克隆的；在平板上桃单菌落， R1000PBI：置于液体LB＋50mg／lkana培养基中， A32置于液体LB＋50mg／lk ana＋50mg／lspc培养基中，于27℃摇床上培养20－25小时，至细菌处于对数生长期时， 3000rpm离心10分钟，弃上清，菌体用1／2MS液体培养基悬浮并稀释5－10倍，至（OD600值＝0．1－0．2），稀释好的菌液用于转化；哺育细胞：使用生长迅速的胡萝卜悬浮细胞系；基因转化步骤：采用叶盘法，在超净工作台内剪下外植体，其中子叶、真叶完整地连叶柄剪下，下胚轴要注去除生长点，将剪好的外植体放入稀释好的菌液中浸泡2－3分钟，用无菌滤纸吸下表面菌液；用无抗生素的MS固体培养基倒入直径为12CM的培养血白，待冷却，在其上铺少许胡萝卜细胞，放上一层无菌滤纸，将吸菌液的外植体置其上，培养血封上Parafilm后置于暗箱中3－4天，进行培养与转化；将转化后的外植体转入含不同激素条件的诱导培养基上，其中加入100mg／l kana500mg／l card，进行筛选与诱导，直至再生抗性芽及植株的产生，取其中的叶片和愈伤组织用于检测；GUS检测：大肠杆菌GUS基因编码一个β-葡萄糖醛酸苷酶，该酶可以分解β-葡萄糖醛酸苷类化合物，若以4－甲基伞形酮酰－β-D-葡萄糖醛酸苷为底物，可以生成带有荧光的4－甲基伞形酮，这个产物可以在激发光365nm，发射光455nm波长下检测到；试剂：10mMβ－meroaptoethanol底物缓冲液：lmM4-methylumbelliferyL-β-Dglucusonide（MUG）用反应缓冲液配制终止缓冲液：0． 2N NaCO3步骤：植物材料收集后，用液氮破碎，加100μl冷反应缓冲液，离心2分钟；取60 μl样品，加60μl底物缓冲液，留一半作对照；另一半37℃保温过夜；加2．0μlNa2Co3；测荧光，激发光365nm，发射光445nm，10nM4-甲基伞形酮为标准；蛋白测定：取20μl步骤1所得上清楚，测OD280、OD260，同时用考马斯亮兰法较正；比较生成4－甲基伞形酮随时间变化的斜率，计算空白与样品间的差异；PCR检测：提取植物DNA步骤，采用CTAB方法，过程如下：取植物叶片，液氮碾磨，放入Eppendoff管中；加入500 μl160℃预热数分钟的2×CTAB提取缓冲液（0． 2％ μ-球基乙醇，20％CTAB，1．4N Nacl，0．1M Tris．Cl PH：8．0，0．02M EDTA）置60℃水浴45分钟；加等体积24：1氯仿：异戊醇，温和晃动数次，5000rpm离心5分钟；上层水相转移到新管中，用24：1氯仿：异戊醇再抽提一次，条件同上；加2／3体积的异丙醇，－20℃沉淀30分钟；10000rpm离心2分钟，弃去上清；重悬于100 μlTE（PH：8．0）中，加1／10体积2M NaOAc和2．5体积无水乙醇沉淀；10000rpm离心2分钟，弃去上清；70％乙醇洗涤两次；常温下风干；DNA沉淀重悬于TE中；电泳，检验植物总DNA含量；反应体系：反应物 加样顺序 体积 终浓度10X缓冲液 1 5μl lX缓冲液4XdNTPMix 2 5μl 200μM/per dNTPPrimerl 3 2μl 50pmol/per reactionPrimer2 4 2 μ l 50pmol／per reaction模板DNA 5 2． 5μ 0． 5μ g／per reactionTag DNA酶 6 3U 2．5-3U／per reactionDMSD 6 2．5μl -加无菌去离子水至100μlCMV外壳蛋白基因两端引物的结构：Primer1：5’＞ATG GAC AAA TCT GAA＜3’Prmer2：5’＞TCA AAC TGG GAG TCA＜3’实验操作程序：将未加Tag DNA polymerase的反应管中的样品混匀，反应管放入95℃水浴中反应10分钟。取出反应管，在台式离心管上快速离心，使冷凝于管盖的液滴沉下，然后，加入Tag DNA Poly merase，混匀并离心，最后加上50→80μl石蜡油，于72℃反应2分钟，即可循环：循环参数： 93℃变性反应30秒55℃退火反应 90秒72℃延伸反应150秒经过30→36个循环后，在进行到最后一个循环时，72℃延伸反应增加5分钟，反应结束后，取出反应管，使之冷却到室温后放于4℃保存，并进一步分析，使用08％琼脂糖凝胶电泳；b．甜椒的组织培养筛选获得抗CMV再生植株：用1、2、3号的甜椒苗的子叶在培养基MS＋6mg／LBA＋3％蔗糖上培养两周后，在子叶上切口处诱导出绿色小芽，每个外植体10-20个，芽展开，并有茎的伸长；共得到4株伸长的芽，将其转入生根培养基上生根，得到再生小植株，该植株正在继续培养，以便移入土壤；在甜椒的离体再生培养过程中，考查了激素、苗龄、位置效应对于分化的影响，在以子叶为外植体的培养过程中， MS＋6mg／LBA＋0． 5mg／LIAA为最佳芽诱导培养基， MS＋lmg／LGA3＋2mg／LZT伸长培养基， MS＋0． 5IAA为生根培养基；苗龄：子叶外植体的生理年龄是影响器官再生的因素之一，在本实验中，比较了5天，12天，30天苗龄的子叶分化的情况（见表2），结果表明： 12天苗龄的子叶分化能力最强，30天苗龄的子叶诱导出芽时间长，分化能力有所降低，芽伸长也较难；5天苗龄的子叶只能诱导出胚性愈伤和少数芽点；位置效应：在甜椒再生过程中，位置效应也是一个重要的影响因素，在这方面， Fari，M和Czako，M曾于1981年报道下胚轴的分化情况，即基部的下胚轴分化出根，上端胚段分化出芽，我将子叶横切为二，置于培养基MS＋6mg／LBA＋0． 5mg／LIAA上，发现上半部分几乎无分化能力，而带有叶柄的基部子叶分化频率为100％，而且两端切口处呈现不同分化趋势、从基部分化出根，从端部分化出芽。这个效应对以后的芽伸长及再生有较大影响；3）甜椒的离体再生株的获得：以苗龄10－16天的子叶为外植体，经过芽诱导、芽伸长、根诱导、移入土壤四个步骤的离体培养，已获得能正常开花结实的再生植株，所用培养基以MS为基本培养基，附加不同种类不同浓度的植物激素，最适的芽诱导培养基，芽诱导率可达100％，诱导出的芽转入芽伸长培养基上，可使芽伸长，伸长率为35％左右，已伸长的芽在生根培养基MS或MS＋0，1－0． 5mg／LNAA上生根后，转入土壤成为正常植株。