一种用基因工程方法培养的抗病香料烟草
一种用基因工程方法培养的抗病香料烟草是从感染烟草花叶病毒的叶片中提取ＴＭＶ经ＣｓＣｌ梯度提纯，提取ＴＭＶ_ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ，对一个ｃＤＮＡ克隆ｐｌｃｓ７２的序列测定进一步由ｃＤＮＡ库中获得含外壳蛋白基因（ｃｏａｔ_ｐｒｏｔｅｉｎ_ｇｅｎｃ，简写ｃｐ_ｇｅｎｅ）片段并转入Ｔｉ质粒，获得特制Ｔｉ质粒，用特制Ｔｉ质粒浸染烟草叶片，用这些叶片进行组织培养，育成完全的基因工程抗ＴＭＶ工程植株，经大田中试，化验评吸，确定为有生产前途的抗病毒基因工程香料烟草。
发明专利
CN95102130.3
1995-03-09
CN1112605
1995-11-29
C12N15/29
北京大学
陈章良; 孙宝俊
100871北京市海淀区北京大学
北京大学专利事务所
孙博宁
北京;11
一种用基因工程方法培养的抗病香料烟草，其特征是：所述方法包括TMV纯化、TMV RNA提取、cDNA合成、TMV cDNA测序、TMV外壳蛋白基因（CP基因）的获得，用TMV外壳蛋白基因转化烟草细胞的培养及选育；1）．病毒TMV的提取纯化：摘取被侵染TMV的叶片5g，按3：1（V／M）加入0． 1M硼酸缓冲液pH7．0（0． 1M硼酸，0． 5mM EDTA， 5mM 2－Me PH7．0），研磨成匀浆， 1000克离心20－30分钟，取上清液加入PEG（6000）和NaCl使终浓度分别是4％和1％，在4℃－6℃下搅拌3－4小时，10，000克下离心30分钟，将沉淀悬浮在1／4原体积1／15M的磷酸缓冲液中（PH7．0）7， 000克下离心10－15分钟，取上清液重复PEG沉淀及差速离心，取上清液加到预铺好的CsCl上（预铺CsCl梯度10％，20％，30％，40％的CsCl，等体积依次加入），RP－55T rotor， 30， 000rpm3小时，用注射器吸出TMV带，用无菌水稀释，再用35，000rpm离心1小时，沉淀溶于水中；2）．TMV RNA的提取：TMV（2mg／ml）加入2X蛋白酶K缓冲液，再加蛋白酶K使其终浓度达50μg／ml，37℃下保温30～40分钟，两次等体积苯酚－氯仿，除去乙醚，加入2．5倍体积的无水乙醇，在－70℃放置20－25分钟，取出13，000－14，000rpm离心20－25分钟，沉淀用1ml 70％冷乙醇洗一次，13，000～14，000rpm离心10－12分钟，倾去液体，将沉淀抽干，然后加ddH2O50μl溶解；3）．cDNA的合成：A．合成PrimerTMV RNA上无polyA，因而逆转录合成cDNA的引物（Primer）需要人工合成，根据前人对TMV tomato stain的序列分析，设计合成了一般与已知序列3’端141-160碱基互补的序列；具体如下： 160 141tomato stain RNA-ACGUGGUACGUACGAUAACG-Primer TGCACCATGCATGCTATAGC其中第143号碱基的改变造成了一个EcoRV的酶切位点；B． cDNA的合成a．第一链的合成RNA 1μg 0．38μg／μl 5μlPrimer 0．5μg 0．3μg／l 2μlddH2O 22 μ l煮沸1分钟，马上放在冰上Rnasin fou／μl 1μllst buffer 10x 5μlDTT 100mM 5μldNTDs 10mM 5μl32P-dATP 10μg／μl（1．5μl释4μl） 2μlAMV RTase 95μ／μl 2μl44℃保温1小时，追加AMV RTase 9．5μ／μ l，44℃保温1小时。b．第二链的合成dd氢 125μl2nd strand buffer 10x 23μlDTT 100mM 23μlNTDs 1mM 7μl32PdATP 10 μci／μl（1．5μl释4μl）2μlE Coli DNA ligase 1μ／μl 1μl16℃保温30分钟，加RNase H1．9p／l，16℃保温2小时；c．将CDNA补成平未端：70℃加热10分钟，离心一下，放置在冰上；加入T4DNA poly－merase 9μ／μl 0．5μ／μgRNA，37℃保温30分钟，加入20μl 0．25MEDTA 1／2Vol 7． 5M NH4AC 3倍体积乙醇，冰浴5～10分钟，离心13， 000rpm离心30分钟，干燥沉淀，沉淀溶到20l ddH2O中；d．对一链、二链处理5μl一链，30μl链，分别进行，加入1／10体积0．25M EDTA，1／10体积2N NaOH，65℃保温1小时，加入1／2体积7． 5M NH4AC 3倍体积乙醇，冰浴5～10分钟，离心13，000rpm离心30分钟，用80％冷乙醇洗，13，000rpm离心5分钟，干燥沉淀，溶于20μl碱性胶载样缓冲液中，点样前煮5～10分钟变性；C．碱性胶电泳，常规方法；D． cDFA连入BLUESCRIPT－－sma I位点；E．将连接好的质粒转入E，ColiDH5株感受态细胞中；cDNA克隆的鉴定：从经转化处理后的诸菌株中筛选cDNA插入克隆约100个，定名为pLcsN，并提取质粒。从cDNA克隆到Bluescript质粒中筛选获得不同大小的克隆分别编号为： plcs23， plcs24，plcs72，plcs65， plcs64，plcs73， plcs26， plcs66， plcs44；4）．病毒TMVcDNA序列的测定：克隆中任意选了一株，名字是plcs72，其插入cDNA大小为1． 8Kb左右。用kleuow方法对其进行序列测定；A．质粒的小量提取：采用分子克隆上小量提质粒的方法，为适应测序要求的高纯度而略有变化，其一，第九步重复一次，以尽可能除去白色沉淀，其二，在苯酚－氯仿抽提前加入无DNA酶的RNA酶，终浓度为20g／l，37℃保温40～60分钟，其三，苯酚-氯仿以后，再用1借体积氯仿：异戌醇（24：1）洗二次，其四，干燥后的沉淀溶于50μl TE（PH8．0）后，加入30μl120％PEG（6000， 8000）-2 5MNaCl倒置混匀水浴60分钟（-70℃5-10分钟）12，000克离心15分钟，吸去上清，用1μl 70％冷乙醇洗沉淀离心抽干，将沉淀溶解在50μl TEPH8．0中；B．质粒的碱变性：加5． 5μl 2N NaOH，在室温下放置5分钟，再加20μl 50M NH4Ac混匀，加入27的无水乙醇，冰上保温60分钟（－70℃5μl）取出在12，000克下离心10分钟，用200μl，70％乙醇洗，离心后，抽干沉淀，沉淀溶于ddH2O中，使其浓度是0．5μg／μl左右；C．引物与模板的结合：取6μl模板（～3μg），加1．5μl 10×klenow buffer 3μl T7prmer l0μg／μg混匀，把Ependorf管漂在一个250μ l装满水的烧杯中，放入微波炉加热，侍水开始沸腾，取出烧簿，使其在室温下自然降温，降到室温后，室温下离心进行下一步；D． Klenow测定DNA序列：再加入4μlα－32P－dATP（或5μl－α35与－dATP及1．0～1．5μl Klenow（7μ／μl）混匀；再注有A、C、G、T四个硅化的Eppendorf管中加入3μl的dNTP 5ddNTP混合物，迅速加入刚混好的模板和酶的混合物3μl， 37℃－40℃再保温30分钟，取出，分别加入1μl追加溶液37℃－40℃再保温30分钟，加入5μl 反应停止液；E．序列胶采用8％聚丙烯胺胶，0．4mm厚，成份：丙烯胺 甲叉丙烯胺胶 尿素 10 ×TBE ddH2O 10％APT EMED7．6g 0．4g 48g 10ml 40ml 500μl 50μl放射自显影，序列测定结果如下：（1）用plcs 72质粒，模板准备；依次：λdⅢ plcs72ds plcs72ds plcs72ds上样量： 4μl 6μl 6μl 6μl（2）以自显影进行序列分析：对plcs72的初步测定，获得如下结果，从胶上读出TATCG，ATAAG，CTTGG，ATATC，ATCGG，AATTC，CTGCA，GCCCG，TAATA，CATCA，CGACA，GAGGA，TGCAT，TGTGT，ATTC，GATCC，CCTAA，AGTTG，ATCTC，GAAAC，TTGGT，（G）CTAAA，CACCA，TCAAG，GATTG，GGAAC，ACTTG，G，共136bp，其中polylnker39个，cDNA97bp；5）．TMV外壳蛋白基因（CP基因）的获得：已经确定TMVCP基因在3’端， CP基因长为500bp左右， cDNA合成由3’端开始，所以只要约800bP的cDNA就有可能取得需要的基因，经过酶切鉴定，选出plcs70和plcs26两个质粒，它们片段大小分别是900bp及1．1Kp，其中包括了CP基因；将CP基因转到土壤农杆菌Co24质粒；转入的方法有两种：a．用双酶切出，定向连入Co24；用Bam H I和EcoR I切出cDNA，用Bgl II， EcoR I 切Co24， BamHI与Bgl II同尾，很容易把含CP基因的片投定向转入Co24：b．用酶切出cDNA，用酶切开Co24后，用Klenow把所有片段补成平末端，连接筛选。由这种方法可以获得两个方向的插入；对p1cs70使用方法a，对plcs26使用方法b；6）．用上述5）中的TMV外壳蛋自基因转化烟草细胞的培养及选育出抗病毒TMV烟草：菌株及菌液制备：选用土壤农杆菌GV3111－SE（PTiH40）；挑取单菌落，在LB＋Km50mg／l＋Cm25mg／l＋SPC100mg／l液体培养基中， 200rpm， 28℃培养24－36小时，至细菌处于对数生长期时，3000rpm离心10分钟，弃上清，菌体用1／2MS液体培养基悬浮，稀释5－20倍；稀释好的菌液用于转化；烟草材料：取温室中新鲜的巴什马型香料烟（Oriental tobocco）的烟草叶片，清水洗净；先放入75％乙醇中消毒30秒，再入10％次氯酸钠溶液中消毒8－10分钟，无菌水清洗三次；将表面消毒好的叶片剪成1平方米的叶块，用于转化；哺育细胞：选用生产迅速的胡罗卜悬浮细胞系；植物培养基：（1）T1，（用于细胞和叶片共培养），MS培养基，3％蔗糖，1mg／l6－BA，0．1mg／l NAA，琼脂粉0．9％，PH＝5．6－5．8，高压灭菌；（2）T2，（用于预培养）， T1培养基，500mg／l ，苄青霉素（carb）；（3）T3，（用于筛选培养），T1培养基，100mg／l km， 500mg／lcarb；（4）T4，（用于生根），MS培养基， 100mg／l，500mg／l carb；哺育细胞培养基： B5培养基；细菌培养基： LB培养基，附加不同种类和浓度的抗生素；转化步骤：（全部在无菌条件下进行）将叶片放入制备好的菌液中，浸泡3－5分钟取出，在无菌滤纸上吸干表面菌液；T1培养基表面铺一层哺育细胞，其上覆盖一无菌滤纸，将1中已浸菌的叶块摆放在滤块上；28℃，黑暗中共培养48小时；将叶块转入T2培养基中，放置光下，25－28℃培养24小时；将叶块转放T3培养基中，光下25－28℃培养，约15天后叶块切口处有愈伤组织形成和芽点的分化；叶块继续在T3上培养基，每20天左右换一次新鲜培养基，约2－3个月后，芽可长成高3－5cm的小植株；切下较大的小植株，转T4培养基中，20天左右开始有根生成；继续培养40天左右，形成发达根系；从培养瓶中取出根系发达的植株，无菌水洗净琼脂，移入土壤中；开始2－3周将植株用罩子罩住，待植株健壮后，取下罩子，在温室中培养（这步不需在无菌条件）；至此，已获得转基因烟草植株。