一种制备重组链激酶的方法

摘要：

一种重组链激酶的制造方法。现有技术的基因构建过程繁琐，大肠杆菌中表达水平低，纯化方案复杂。本发明方法用ＰＣＲ扩增链激酶基因，与原核表达载体如ＰＬY－４组装成表达质粒ＰＳＴＥ－ＳＫ－１，转化大肠杆菌后用温度诱导ｒ－ＳＫ基因表达。工程菌经发酵扩增，破碎细菌，离心收集包涵体，复性后经二步法纯化ｒ－ＳＫ。本方法所得产品的产量和纯度都很高，成本低。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN94112106.2

申请日期：1994-04-04

公开/公告号：CN1096326

公开/公告日：1994-12-14

主分类号：C12N9/70

申请/专利权人:上海医科大学

发明/设计人:宋后燕

主申请人地址:200032上海市医学院138号

专利代理机构:上海医科大学专利事务所

代理人:吴桂琴

国别省市代码:上海;31

权利要求：

一种重组链激酶的制备方法，包括链激酶基因质粒的构建，在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化和大规模制造产品的工艺，其特征在于：（１）从人体口腔分离溶血性链球菌，培养液中提纯链激酶，测定Ｎ末端和Ｃ末端氨基酸顺序作设计ＰＣＲ引物的参考。用溶血性链球菌大分子ＤＮＡ作模板，通过ＰＣＲ直接扩增链激酶基因，链激酶基因经核苷酸顺序分析证实后与原核表达载体，例如含ＰＬ，ＰＲ启动子，ＣＩＴ８５７基因以及５ＳＲＮＡ终止信号等调控元件的ＰＬＹ－４质粒组装成高效表达质粒ｐＳＴＥ－ＳＫ－１；（２）ｐＳＴＥ－ＳＫ－１转化大肠杆菌，用温度诱导ｒ－ＳＫ基因的表达，以包涵体形成存在于工程菌内；（３）通过发酵技术扩增工程菌，用Ｍ９ＣＡＡ作基础培养液，温度诱导前后用ＬＢ、葡萄糖、稀有元素溶液等进行数次补液，发酵参数为温度３０－４２℃，氧溶量为５０－８０％，ＰＨ６－８；（４）发酵后用高压破碎细菌，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，盐酸胍溶解，和ｒ－ＳＫ的复性后，再用凝胶过滤，离子交换二步法纯化产品。