一种重组葡激酶的制备方法

摘要：

一种重组葡激酶的制备方法，现有技术中重组质粒表达水平低，纯度低，而且得率也很低。本发明通过PCR扩增葡激酶基因，与原核表达载体如PLY－4质粒重组，形成pSTE－SAK－1表达质粒，pSTE－SaK－1转化大肠杆菌，用温度诱导基因表达。工程菌经发酵扩增，压榨破碎细菌，用离子交换和凝胶过滤二步法从上清液纯化r－Sak，本方法得到的葡激酶产品纯度和得率都很高，成本低。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN94112105.4

申请日期：1994-04-04

公开/公告号：CN1096325

公开/公告日：1994-12-14

主分类号：C12N9/48

申请/专利权人:上海医科大学

发明/设计人:宋后燕

主申请人地址:200032上海市医学院138号

专利代理机构:上海医科大学专利事务所

代理人:吴桂琴

国别省市代码:上海;31

权利要求：

一种重组葡激酶的制备方法，包括葡激酶基因克隆的构建，在大肠杆菌中的表达，以及工程菌的发酵，和表达产物的分离、纯化等，其特征在于：（１）从人体分离溶血性金黄色葡萄球菌，选择纤溶活性最高者大量培养，从培养液提纯葡激酶，测定其Ｎ和Ｃ端５个氨基酸顺序作设计引物的参考，以该菌株大分子ＤＮＡ作模板，通过ＰＣＲ直接扩增葡激酶基团，与质粒载体重组合，比核苷酸顺序分析基因结构；（２）ｒ－ＳａＫ基因与原核表达载体，含ＰＬ、ＰＲ启动子、ＣＩｔ８５７基因、５ＳＲＮＡ终止信号等调控元件的ＰＬＹ－４质粒重组，形成表达质粒，转化大肠杆菌，用温度诱导ｒ－ＳａＫ基因的表达；表达产物ｒ－ＳａＫ以可溶性、活性状态存在于细胞浆中；占菌体总蛋白４０％以上。（３）发酵技术：用低营养基础培养工程菌，温度诱导前后用ＬＢ，葡萄糖，稀有元素溶液补料，发酵时温度为３０－４２℃，ＤＯ＝５０－８０％，ＰＨ＝６－８，搅拌速度随ＤＯ升高而减少；（４）工程菌用压榨破碎，离心后，经离子交换、凝胶过滤二步法从上清液纯化ｒ－ＳａＫ。