一种人白细胞介素-2的基因合成表达质粒的构建及产物的生产工艺
白细胞介素－２是作为一种免疫药物可用于治疗某些病毒性疾病和癌症，有很好的应用前景，临床需要量很大，是国际上竞相开发的产品。本发明是通过构建带有天然白细胞介素－２基团的表达质粒，在大肠杆菌中高效表达，表达量达菌体总蛋白的３０—４０％。本发明还建立了一个高效的包涵体分离技术和获得高比活的白细胞介素－２纯化方法，这为大量生产白细胞介素－２创造了很好的条件。
发明专利
CN94112090.2
1994-03-29
CN1109907
1995-10-11
C12N15/26
中国科学院上海生物化学研究所
刘新垣
200031上海市岳阳路320号
中国科学院上海专利事务所
衷诚宣% 汪克臻
上海;31
一种人白细胞介素－2（IL－2）基因的合成及表达质粒的构建，其特征是：（a）使用人工设计、化学合成的基因，基因结构式如下：AATTCTT ATG GCT OOG ACT TCT TCT ACT AAA AAG ACT CACMet Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr GloCTT CAG CTG GAA CAT CTG CTG CTG GAC CTC CAG ATG ATC CTG AACLeu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu AsnCCT ATC AAC AAC TAC AAA AAC CCG AAA CTG ACC CGT ATG CTG ACCGly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu TnrTTC AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA CTG AAA CAT CTGPhe Lys Phe Tye Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His LeuCAG TGC CTT GAA CTG AAA CCG CTG GAA GAA GTT CTG AACGln Cys Leu Glu Glu Leu Lys Pro Leu GLu Glu Val Leu AsnCTG GCT CAG TCT AAA AAC TTC CAT CTG CGT CCG CGT GAC CTG ATCLeu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu IleTCT AAC ATC AAC GTT ATC GTT CTG GAA CTG AAA GGT TCT GAA ACCSer Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu ThrACC TTC ATG TGC GAA TAC GCT GAC GAA ACC GCT ACC ATC GTT GAGThr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val GluTTC CTG AAC CGT TGG ATC ACC TTC TCG CAG TCT ATC ATC TCT ACCPhe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser ThrCTG ACC TGA TAG GATCLeu Thr Thr TermTermIL-2由133个氨基酸组成，合成的该基因有399bp，加上起始密码子ATG，终止密码子TAG和TGA及5’和3’未端克隆用的限制性内切酶切点，共有421 bp，选用了大肠杆菌使用频率高的密码子，使合成的IL-2基因能在大肠杆菌中高效表达，产生大量的人IL-2，而不改变IL-2的氨基酸顺序；（b） 将合成的IL-2基因克隆入带有PL启动子CIts857温控阻遏蛋的基因、核糖体5S rRNA基因终止信号t1t2和MCS区的基因载体pLy－4中，构建成IL－2的表达质粒PLy1－IL－2，转化大肠杆菌后获得高效表达；转化后的工程菌为大肠杆菌Escherichia coli SIB-203-lpLy4-LL，保藏编号： CCTCC NO．（中国典型培养物保藏中心，中国，武汉，珞珈山武汉大学校内）；（C）表达产物以包涵体的形式存在，得包涵体产物后用8M盐酸胍溶解， 上Sephacryl S-200柱，一步柱层析可以得到纯度）95％，比活）2×108Boehringer单位／毫克蛋白的IL－2，相当于1． 2×107国际单位／毫克蛋白的IL－2。