利用昆虫细胞高效表达人尿激酶原及其它有用蛋白质的方法
本发明通过基因工程技术，构建了新型高效表达的昆虫核多粒包埋型多角病毒转移载体。该质粒多角体蛋白启动子基因结构完整，３＇－端同源序列区小于普通转移载体质粒，人尿激酶原基因被插入到该质粒中，得到了高效表达。通过在培养的昆虫细胞中进行同源重组得到含人尿激酶原基因的重组昆虫核多粒包埋型多角体病毒。由此感染的昆虫细胞高活性高效表达人尿激酶原并直接分泌到培养基上清中。单克隆抗体亲和层析一步法回收与纯化表达的人尿激酶原蛋白质。
发明专利
CN93102115.4
1993-03-04
CN1075165
1993-08-11
C12N15/85
北京大学
徐扬; 胡美浩; 张洪涛
100871北京市海淀区
北京大学专利事务所
孙博宁
北京;11
一种利用昆虫高效表达人尿激酶原及其他有用蛋白质的方法；其特征在于用重组体杆状病毒感染的昆虫细胞高效表达人尿激酶原及其他有用蛋白质，所述方法包括：（1）构建高效表达的转移载体质粒pAcYT：用限制性内切酶酶切去除质粒pAc373启动子基因的XhoI－BamHI片段（2．1Kb），得到不含启动子的pAc373’DNA XhoI－BamHI大片段（7．7Kb），将3’－下游修饰过的克隆野生型AcMNPV DNA多角体蛋白启动子基因片段（XhoI－BamHI片段，2．1Kb）与7．7Kb的pAc373’DNA XhoI－BamHI大片段连接，再去除一段多角体蛋白结构基因下游的DNA片段（BamHI0KpnI片段），得到一个新的具有添加的启动子下游DNA片段TATAAAT并缺失多角体蛋白结构基因下游BamHI－KpnI片段的高效表达转移载体pAcYT．DNA序列测定表明：pAcYT启动子基因比pAc373多一段TATAAAT序列，即本发明所构建的高效表达转移载体pAcYT启动子部分结构比pAc373更完整，使外源基因在完整多角体蛋白启动子控制下被表达；（2）克隆人尿激酶原cDNA到转移载体pAcYT上：经二次分别分段重组人尿激酶原cDNA到质粒BIue－script和pUC19上以得到BamHI、KpnI未端，然后平头正向插入到转移载体质粒pAcYT的BamHI位点上（见图1），将pAcYT／UJK质粒扩增后，用氯化艳密度梯度离心或PEG8000沉淀等常规DNA纯化方法进行纯化；（3）病毒和细胞及病毒DNA制备：昆虫细胞株Sf9细胞在TMN－FH或IPL41培养基中培养；昆虫细胞株Sf21细胞在TC-100培养基中培养；用核多粒包埋型多角体病毒感染Sf细胞以增殖病毒，高速离心（4℃，30000转／分）沉淀培养基上清中的病毒粒子，低浓度Na2CO3裂解多角体．蛋白酶K水解病毒蛋白质，酚氯仿抽提一次，乙醇沉淀病毒DNA（4）昆虫细胞内同源重组病毒的筛选：将带有人尿激酶原cDNA（含分泌肽编码序列）的pAcYT／UK DNA1－5微克与野生型AcMNPV DNA2－10微克悬浮于30微升蒸溜水中，与30－50微克脂质体混合后共转染单层贴壁Sf细胞，25℃－28℃温育2－4小时，吸弃转染液．换新鲜培养基， 25℃－28℃培养4－7天．直至病毒多角体形成，根据重组病毒无多角体10cc－）这一形态学特征．用空斑法筛选纯化，重复三次，获得重组病毒；（5）带有人尿激酶原基因的重组病毒感染sfg细胞：每毫升sfg细胞用10 3PFU（空斑形成单位）的重组病毒感染，4－7天后收集培养基上清（含有表达产物人尿激酶原），并以野生病毒为对照；（6）纯化与回收表达产物人尿激酶原蛋白质：将溪化氰活化的Sephgrose 48凝胶与抗人尿激酶单克隆抗体（4D1E8）偶联后装柱，柱床体积2．5毫升，每次上样体积30－60毫升．用2mo1／LKSC洗脱．收集人尿激酶原洗跷峰流出液，在Aprotinin（Sigma）存在下透折，低温真空干燥。