克隆有人肿瘤坏死因子α(TNF)基因的变铅青链霉菌的构建方法
本发明涉及克隆有人肿瘤坏死固子－α基因的变铅青链霉菌的构建方法。本发明方法采用基因工程技术，以质粒Ｐ<sup>IJ486</sup>为载体，其中包括通过Ｔ４－ＤＮＡ连接酶将分别用ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ双酶切得到的质粒Ｐ<sup>HTI</sup>TNFcDNA片段和质粒P<sup>IJ486</sup>片段进行连接，通过转化使其克隆至变铅青链霉菌ＴＫ５４，挑选转化子，提取重组质粒，得到Ｎｏ７转化子，获得了克隆有人肿瘤坏死因子－α基因的变铅青链霉菌ＴＫ５４－ＨＴ（含有重组质粒Ｐ<sup>IJT7</sup>），将该克隆菌株进行发醇培养，即可获得肿瘤坏死因子蛋白，其表达水平可达１×１０<sup>7</sup>单位／升以上，菌种遗传性稳定。
发明专利
CN91103105.7
1991-05-17
CN1055200
1991-10-09
C12N15/09
中国医学科学院医药生物技术研究所
李元; 刘菊萍; 李焕娄; 石莲英; 刘伯英
100050北京市天坛西里1号
三友专利事务所
杨佩璋
北京;11
克隆有人肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ）基因的变铅青链霉菌的构建方法，其中包括酶切、连接、转化、挑选转化子提取重组质粒和经确证后得到所需菌种五个步骤，其特征在于： ａ、连接：以质粒Ｐ↑［ＩＪ４８６］为载体，将经过限制性内切酶ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ双酶切得到的质粒Ｐ↑［ＨＴ１］ＴＮＦ↓［ｃ］ＤＮＡ片段和经过限制性内酶ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ双酶切得到的质粒Ｐ↑［ＩＪ４８６］片段相连接，ｃＤＮＡ片段浓度和载体ＤＮＡ浓度比为３～５：１，加入Ｔ４ＤＮＡ连接酶，于１０～１４℃放置３小时以上进行连接，获得重组ＤＮＡ分子； ｂ、转化：采用上述ａ步骤中连接后的重组ＤＮＡ，以变铅青链霉菌ＴＫ５４的原生质体为受体，按照Ｈｏｐｗｏｏｄ等人的方法，将连接后的ＤＮＡ转化至所说的受体菌中； ｃ、挑选转化子及提取重组质粒：以含新霉素３０μｇ／ｍｌ的Ｒ２琼脂平板挑选含重组质粒的转化子，凡是挑选出来的耐药菌落多为含重组质粒的转化子，采用Ｋａｔｚ的快速碱变性方法提取含重组质粒的转化子，酶切后的ＤＮＡ片段与在同一琼脂糖凝胶电泳平板上泳动的入噬菌体ＤＮＡ限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ酶切片段的距离进行比较从而确定各片段分子量大小，其中№７转化子所含重组质粒Ｐ↑［ＩＪＴ７］插入片段为６１５ｂｐ与ＴＮＦｃＤＮＡ相同，经Ｌ９２９细胞毒实验、中和实验和ＳＤＳ－聚丙酰胺凝胶电泳确证：№７转化子为人肿瘤坏死因子－α的基因工程菌。