克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法
本发明涉及微生物领域，特别是克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法。本发明采用基因工程方法，其中包括采用质粒Ｐ<sup>IJ702</sup>为载体对生米卡链霉菌总ＤＮＡ进行鸟枪克隆，转化至变铅 青链霉菌ＴＫ５４，挑选转化子和提取重组质粒，得到№９转化子，将自№９转化子提取得到的№９重组质粒转化至螺旋霉素链霉菌，挑选克隆有№９重组质粒的转化子，得到克隆有丙酰化酶基因的包括№６１在内的螺旋霉素链霉菌，将该螺旋霉素链霉菌进行发酵即可工业生产丙酰螺旋霉素，丙酰螺旋霉素在总产物中含量在２０％以上，菌种遗传性稳定。
发明专利
CN91100023.2
1991-01-09
CN1052507
1991-06-26
C12N15/09
中国医学科学院医药生物技术研究所
李元; 李焕娄; 石莲英; 刘伯英; 李晓平
100050北京市崇文区天坛西里一号
三友专利事务所
杨佩璋
北京;11
克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法，其特征在于： ａ、鸟枪克隆：以质粒Ｐ↑［ＩＪ７０２］为载体将经限制性内切酶Ｂｇ１Ⅱ分别酶切过的米生卡链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ－ｍｙｋａｒｋｆａｃｉｅｎｓ）总ＤＮＡ和Ｐ↑［ＩＪ７０２］质粒ＤＮＡ，以３～５：１浓度比，在Ｔ－ＤＮＡ连接酶作用下，于１０～１４℃放置３小时以上进行连接反应，得到重组ＤＮＡ分子。 ｂ、转化：采用ａ步骤中连接后的重组ＤＮＡ，以变铅青链霉菌ＴＫ５４的原生质体为受体，按Ｈｏｐｗｏｏｄ等人的方法将连接后的ＤＮＡ转化进入所说的受体菌中； ｃ、挑选转化子及提取重组质粒：以含硫链丝菌素终浓度为２５微克／毫升的Ｒ２琼脂平板挑选含重组质粒的转化子，在所说的含硫链丝菌素Ｒ２平板上所选的白色菌落即为含重组质粒的转化子，然后采用快速碱变性方法提取含重组质粒转化子，将琼脂糖凝胶电泳后确定为重组质粒的样品再进行限制性内切酶Ｂｇ１Ⅱ的酶切，酶切后的ＤＮＡ片段与在同一琼脂糖凝胶电泳平板上泳动的入噬菌本ＤＮＡ限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ酶切片段泳动距离进行比较，从而确定各片段分子量大小，挑选出其中质粒分子量为１０．０ｋｂ，插入片段为４．１６ｋｂ的ＮＯ．９重组质粒；从而得到ＮＯ９重组质粒ＤＮＡ； ｄ、ＮＯ．９重组质粒的转化：以螺旋霉素链霉菌为受体菌，按照Ｈｏｐｗｏｏｄ等人的方法，将该ＮＯ．９重组质粒转化进入受体菌内，使丙酰化酶基因在其中克隆和表达；ｅ、挑选克隆有ＮＯ．９重组质粒的转化子。 在含硫链丝菌素终浓度为２５微克／毫升的Ｒ２再生琼脂平板上进行挑选转化子，采用Ｈｏｐｗｏｏｄ等人的方法进行原位杂交，以ＮＯ．９重组质粒为探针，与固定于销酸销酸纤维素薄膜上经过变性处理的转化子ＤＮＡ进行原位杂交，从中挑选出阳性杂交结果的克隆菌株，因此，获得克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌。