用家蚕幼虫蛹表达外源基因的方法
本发明属于基因工程领域。$是用家蚕幼虫和蛹表达外源基因的方法，采用带有外源目的基因的苜蓿银纹夜蛾Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病毒的质粒与家蚕Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ核多角体病毒共同感染家蚕离体培养细胞杂交重组获得表达，杂交重组的病毒再感染家蚕幼虫和蛹也得到表达。家蚕幼虫可以人工饲养，并且表达水平高于家蚕离体培养细胞的１００倍以上，这种高效表达，具有重要的生产价值和经济意义，能形成基因工程产品产业。
发明专利
CN90102998.X
1990-12-07
CN1062170
1992-06-24
C12N15/63
中国科学院上海生物工程实验基地筹备处
巫爱珍; 孙玉昆
200233上海市漕宝路500号
中国科学院上海专利事务所
华雪增% 巫蓓丽
上海;31
本发明用家蚕幼虫和蛹表达外源基因的方法，属基因工程，包括带有外源目的基因的昆虫病毒质粒，与同种不带外源基因的昆虫病毒核酸二者在其专一的昆虫寄主细胞和虫体中重组表达，其特征是用带有外源目的基因的昆虫为首蓿银纹夜蛾核多角体病毒质粒与不带外源目的基因的家蚕核多角体病毒的核酸，通过共同感染家蚕离体培养细胞得到杂交重组的病毒，再用得到的杂交重组病毒感染家蚕幼虫和蛹得到基因表达具体方法是： ａ）用家蚕核多角体病毒感染家蚕幼虫，用常规方法提纯家蚕核多角病毒及制备核多角体病毒的ＤＮＡ，用于家蚕细胞的转染重组， ｂ）将带有外源目的基因的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒的质粒０．１－５μｇ及家蚕核多角体病毒ＤＮＡ０．２－１０μｇ悬浮于９５０μｌ转染缓冲液（１０－５０ｍＭ－ＨＥＰＥＳ，０．７ｍＭ－Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］，２０－１００ｍＭ－ＮａＣｌ，４－１０ｍＭ葡萄糖，５ｍＭ－ＫＣｌ，０．１－１０μｇ／ｍｌ小牛胸腺ＤＮＡ，ＰＨ６．８－８．２）中加１０－１００μｌ２．５Ｍ－ＣａＣｌ↓［２］溶液，室温放置３０分钟，使之形成纤细沉淀，将其加入单层家蚕细胞，２５－３０℃培养５－１０小时，吸弃转染液，换以培养液，２５－３０℃继续培养２－５天直至病毒多角体形成。取上述转染的细胞培养液经稀释后取２ｍｌ加至培养皿培养单层家蚕细胞上，２５－３０℃保温２－－４小时后，吸弃感染液，用培养液轻轻漂洗单层细胞，在单层细胞上复盖１－２％琼脂凝胶，琼脂凝胶复层用培养液培制含２００μｇ／ｍｌ１５－氯－４－溴－３－吲哚β－Ｄ－半乳糖苷，２５－３０℃培养４－６天至蓝色空斑形成，挑取兰色空斑，再次重复做空斑测定，分离重组病毒。 ｃ）将重组病毒用针刺，注射，口服方法接种家蚕幼虫和蛹。