逆向斑点分子杂交技术

摘要：

一种逆向斑点分子杂交技术,它适用于人体乙肝病毒的检测.本发明通过HBV内源聚合酶的作用,以标记dNTP参入血清,得到标记HBV_DHA,作为分子探针,与标准的HBV_DHA作逆向斑点分子杂交,从而既测定了乙肝病毒HBV_DHA聚合酶的活力,又显示了HBV_DHA的存在.它克服了单独测定HBV_DHA、HBV_DHA,聚合酶或血清免疫标志的缺点,成为确定HBV感染的直接而可靠的依据.

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN85109606

申请日期：1985-12-05

公开/公告号：CN85109606

公开/公告日：1987-06-17

主分类号：C12Q1/70

申请/专利权人:上海市肿瘤研究所

发明/设计人:陈渊卿; 顾键人

主申请人地址:上海市东安路270号

专利代理机构:上海专利事务所

代理人:吴淑芬

国别省市代码:上海;31

权利要求：

一种逆向斑点分子杂交的检测方法，包括以下步骤　　对含有完整ＨＢＶ－ＤＨＡ顺序的重组质粒作变性处理；　　将所述经变性处理的重组质粒放入冰溶中速冷；　　在所述速冷后的重组质粒内加入氢氧化钠使后者的浓度为０．２－０．５０克分子；　　将所述的氢氧化钠溶液点样于硝基纤维滤膜，并使之干燥；　　将所述点样后的滤膜用缓冲系统浸泡中和，并使之干燥；　　将所述干燥后的滤膜放入预杂交液中进行预杂交；　　将受捡血清加入非离子去垢剂及聚合酶保护剂；　　将所述血清再加入包含缓冲系统及四种ＤＨＡ合成的前生物三磷酸脱氧核苷、其中至少有一种带有可显示的标记物的反应混合液、进行培育、制成含标记物的ＨＢＶ－ＤＨＡ分子探针；将所述含标记物的ＨＢＶ－ＤＨＡ分子探针加入杂交混合液，作变性处理、制成单链的含标记物的ＨＢＶ－ＤＨＡ分子探针；　　将所述的单链含标记物的ＨＢＶ－ＤＨＡ分子探针放入冰浴中速冷；　　将所述速冷后的单链的含标记物的分子探针与上述经预杂交液杂交处理的硝基纤维杂交滤膜杂交，并用洗脱液洗去未杂交的游离的标记物；　　将所述杂交后的硝基纤维杂交滤膜干燥后，通过标记物显示的方法来判定受捡血清中感染性的ＨＢＶ的存在。