58个人类Y染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用
本发明公开了58个人类Y染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用。利用六色荧光标记技术对58对特异性引物进行分组荧光标记，通过引物序列和工作引物浓度的设计和优化，实现了55个人类Y染色体基因座和3个Indel位点的同时高效、特异、灵敏扩增。该复合扩增体系的检测结果具有很高的个体识别能力，且具有良好的数据兼容性，能够满足Y库建设的更高需求，在父系亲缘关系鉴定、家系排查等方面起到了重要作用，有效降低了人类DNA分型的检测成本，提高了检测的工作效率。
发明专利
CN202410617021.1
2024-05-16
CN118345151A
2024-07-15
C12Q1/686(2018.01)
基点认知技术(北京)有限公司
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北京科迪生专利代理有限责任公司
赵磊
北京;11
1.一种58个人类Y染色体基因座的复合扩增试剂盒，其特征在于，包括以下人类Y染色体55个STR基因座和3个Indel位点：rs199815934、DYS456、DYS549、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、DYS447、DYS557、DYS617、DYS587、DYS713、rs771783753、DYS391、DYS388、DYS570、DYS635、DYS448、DYS437、DYS527a、DYS527b、DYS444、DYS443、DYS552、DYS612、rs759551978、DYS393、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS438、DYS576、DYS645、DYF404S1a、DYF404S1b、DYS508、DYS630、DYS460、DYS458、DYS481、DYS385a、DYS385b、DYS449、DYS596、DYS459a、DYS459b、DYS510、Y_GATA_A10、Y_GATA_H4、DYS533、DYS627、DYS518、DYF387S1a、DYF387S1b、DYS593、DYS522、DYS622、DYS520； 所述55个STR基因座和3个Indel位点的扩增引物的序列如SEQ ID NO.1-116所示：其中，rs199815934、SEQ ID NO:1～2；DYS456、SEQ ID NO:3～4；DYS549、SEQ ID NO:5～6；DYS439、SEQ ID NO:7～8；DYS19、SEQ ID NO:9～10；DYS392、SEQ ID NO:11～12；DYS643、SEQ ID NO:13～14；DYS447、SEQ ID NO:15～16；DYS557、SEQ ID NO:17～18；DYS617、SEQID NO:19～20；DYS587、SEQ ID NO:21～22；DYS713、SEQ ID NO:23～24；rs771783753、SEQID NO:25～26；DYS391、SEQ ID NO:27～28；DYS388、SEQ ID NO:29～30；DYS570、SEQ IDNO:31～32；DYS635、SEQ ID NO:33～34；DYS448、SEQ ID NO:35～36；DYS437、SEQ ID NO:37～38；DYS527a、SEQ ID NO:39～40；DYS527b、SEQ ID NO:41～42；DYS444、SEQ ID NO:43～44；DYS443、SEQ ID NO:45～46；DYS552、SEQ IDNO:47～48；DYS612、SEQ ID NO:49～50；rs759551978、SEQ ID NO:51～52；DYS393、SEQ ID NO:53～54；DYS389I、SEQ ID NO:55～56；DYS390、SEQ ID NO:57～58；DYS389II、SEQ ID NO:59～60；DYS438、SEQ ID NO:61～62；DYS576、SEQ ID NO:63～64；DYS645、SEQ ID NO:65～66；DYF404S1a、SEQ ID NO:67～68；DYF404S1b、SEQ ID NO:69～70；DYS508、SEQ ID NO:71～72；DYS630、SEQ ID NO:73～74；DYS460、SEQ ID NO:75～76；DYS458、SEQ ID NO:77～78；DYS481、SEQ ID NO:79～80；DYS385a、SEQ ID NO:81～82；DYS385b、SEQ ID NO:83～84；DYS449、SEQ ID NO:85～86；DYS596、SEQ ID NO:87～88；DYS459a、SEQ ID NO:89～90；DYS459b、SEQ ID NO:91～92；DYS510、SEQ ID NO:93～94；Y_GATA_A10、SEQ ID NO:95～96；Y_GATA_H4、SEQ ID NO:97～98；DYS533、SEQ ID NO:99～100；DYS627、SEQ ID NO:101～102；DYS518、SEQ ID NO:103～104；DYF387S1a、SEQ ID NO:105～106；DYF387S1b、SEQ ID NO:107～108；DYS593、SEQ IDNO:109～110；DYS522、SEQ ID NO:111～112；DYS622、SEQ ID NO:113～114；DYS520、SEQ IDNO:115～116。 2.根据权利要求1所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述Y染色体STR基因座和Indel位点和所对应的引物对在扩增时的工作浓度如下：rs199815934 0.06μM、DYS4560.05μM、DYS549 0.054μM、DYS439 0.045μM、DYS19 0.058μM、DYS392 0.042μM、DYS6430.036μM、DYS447 0.069μM、DYS557 0.087μM、DYS617 0.101μM、DYS587 0.120μM、DYS7130.329μM、rs771783753 0.088μM、DYS391 0.027μM、DYS388 0.066μM、DYS570 0.080μM、DYS635 0.070μM、DYS448 0.115μM、DYS437 0.199μM、DYS527a 0.254μM、DYS527b 0.254μM、DYS444 0.085μM、DYS443 0.064μM、DYS552 0.353μM、DYS612 0.319μM、rs759551978 0.091μM、DYS393 0.030μM、DYS389I 0.051μM、DYS390 0.029μM、DYS389II 0.040μM、DYS4380.049μM、DYS576 0.050μM、DYS645 0.053μM、DYF404S1a 0.074μM、DYF404S1b 0.074μM、DYS508 0.086μM、DYS630 0.107μM、DYS460 0.040μM、DYS458 0.040μM、DYS481 0.065μM、DYS385a 0.056μM、DYS385b 0.056μM、DYS449 0.059μM、DYS596 0.268μM、DYS459a 0.056μM、DYS459b 0.056μM、DYS510 0.077μM、Y_GATA_A10 0.124μM、Y_GATA_H4 0.066μM、DYS5330.050μM、DYS627 0.023μM、DYS518 0.066μM、DYF387S1a 0.039μM、DYF387S1b 0.039μM、DYS593 0.060μM、DYS522 0.070μM、DYS622 0.038μM、DYS520 0.087μM。 3.根据权利要求1所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述基因座的扩增引物的其中一条5’端标记携带有荧光染料。 4.根据权利要求1所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述的55个Y-STR基因座和3个Y Indel位点的扩增引物分为如下五组，分别用五种不同颜色的荧光染料标记五组的扩增引物，每组的扩增引物采用同一种颜色的荧光染料标记，每个基因座的一条扩增引物被荧光染料标记：第一组为rs199815934、DYS456、DYS549、DYS439、DYS19、DYS392、DYS643、DYS447、DYS557、DYS617、DYS587、DYS713；第二组为rs771783753、DYS391、DYS388、DYS570、DYS635、DYS448、DYS437、DYS527a、DYS527b、DYS444、DYS443、DYS552、DYS612；第三组为rs759551978、DYS393、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS438、DYS576、DYS645、DYF404S1a、DYF404S1b、DYS508、DYS630；第四组为DYS460、DYS458、DYS481、DYS385a、DYS385b、DYS449、DYS596、DYS459a、DYS459b、DYS510、Y_GATA_A10；第五组为Y_GATA_H4、DYS533、DYS627、DYS518、DYF387S1a、DYF387S1b、DYS593、DYS522、DYS622、DYS520。 5.根据权利要求4所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述的第一组的荧光染料标记为5’-FAM，荧光染料标记的颜色为蓝色，所述的第二组的荧光染料标记为5’-HEX，的荧光染料标记的颜色为绿色，所述的第三组的荧光染料标记为L552，荧光染料标记的颜色为黄色，所述的第四组的荧光染料标记为LR600，荧光染料标记的颜色为红色，所述的第五组的荧光染料标记为LRL592，荧光染料标记的颜色为紫色。 6.根据权利要求1所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增反应程序如下：95℃～98℃1min～5min；94℃～98℃5s～30s、58℃～62℃30s～1min、72℃20s～1min，共26～35个循环；60℃终延伸5min～30min；所述试剂盒的25μl的扩增反应体系如下：4×反应预混液6.25μl，5×引物混合物5μl，去离子水11.75μl，模板DNA 2μl，其中引物混合物为所述的55个Y-STR基因座和3个Y Indel位点的扩增引物混合物。 7.根据权利要求1所述的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有镁离子、dNTP、DNA聚合酶的反应预混液，55个Y-STR基因座和3个Y Indel位点的等位基因ladder，DNA标准品和荧光分子量内标。 8.一种人类Y染色体55个基因座和3个Y Indel位点的复合扩增方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)样品处理：提取样品的基因组DNA作为扩增模板或直接采用免提取的样品作为扩增模板； (2)利用序列如SEQ ID NO.1-116所示的扩增引物混合物对步骤(1)获得的样本基因组DNA进行扩增； (3)扩增产物的荧光信号检测； (4)收集荧光信号数据，分析得到55个Y-STR基因座和3个Y Indel位点的DNA分型结果。 9.根据权利要求8所述的复合扩增方法，其特征在于，所述样品包括血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液和含有胎儿细胞的羊水中的一种或多种；所述免提取的样品包括滤纸、血卡、棉签、纱布中的一种或多种载体收集的人类血液或口腔细胞。 10.权利要求1-7任一项所述的复合扩增试剂盒或权利要求8-9中任一项所述的复合扩增方法在个体识别或亲子鉴定、人类染色体DNA基因座的数据库构建或DNA家谱构建中的应用。