BHV-1的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用
BHV‑1的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用，属于病毒遗传操作技术领域。为解决现有BHV‑1的基因编辑方法存在效率低、耗时长、重组病毒纯化困难等问题，本发明通过将BHV‑1基因组剪切后分段克隆入Fosmid粘粒载体pCC1Fos，构建了BHV‑1基因组Fosmid文库；在对该文库进行基因组测序的基础上，从中挑选出5个克隆有BHV‑1基因组片段，且相互含有重叠区域，并可以拼接覆盖BHV‑1全基因组的重组粘粒；用这5个粘粒共转染人胚胎肾细胞，成功拯救BHV‑1，获得了BHV‑1的反向遗传操作系统。
发明专利
CN202410114328.X
2024-01-29
CN117646032A
2024-03-05
C12N15/85(2006.01)
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
尹鑫;汪孟航;郭永琪
150069 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号
哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
邓宇
黑龙江;23
1.一种BHV-1的反向遗传操作系统，其特征在于，包含分别含有BHV-1病毒基因组1-41592 nt，54764-91064 nt，99753-135460 nt，22588-61504 nt和65620-102129 nt核苷酸序列的5个重组粘粒，所述BHV-1全基因组序列的GeneBank登录号为NC001847。 2.根据权利要求1所述的反向遗传操作系统，其特征在于，所述5个重组粘粒是通过将BHV-1基因组1-41592 nt，54764-91064 nt，99753-135460 nt，22588-61504 nt和65620-102129 nt核苷酸序列分别与pCC1Fos载体连接获得的。 3.一种构建权利要求1所述反向遗传操作系统的方法，其特征在于，包括如下步骤： S1、提取BHV-1基因组DNA； S2、BHV-1基因组Fosmid文库的构建：将BHV-1基因组DNA片段末端补平修饰，经脉冲场电泳验证，回收30-45 kb之间的DNA片段，取回收后DNA片段与pCC1FOS载体连接获得重组DNA，将重组DNA包装后感染大肠杆菌，经培养后随机挑取单克隆，提取粘粒并进行末端测序，将测序正确的粘粒进行序列拼接，获得覆盖BHV-1全长基因组的Fosmid文库； S3、BHV-1的拯救：从S2中获得的含有30-45 kb基因组DNA片段的粘粒中选取组合，每种组合含有4-5个粘粒，每个粘粒的BHV-1病毒DNA片段两端都能相互重叠，每组粘粒能够覆盖BHV-1全基因组，对各组的粘粒进行纯化，将纯化后的粘粒组合分别转染至HEK293T细胞中，转染后72 h，将细胞反复冻融，将上清接种于MDBK细胞，待细胞病变后反复冻融细胞，收获拯救病毒。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2所述基因组DNA片段是将S1提取的BHV-1基因组DNA通过物理剪切方式获得的随机断裂的基因组DNA片段。 5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2中用噬菌体包装蛋白包装重组DNA。 6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S3所述转染每个粘粒转染剂量为2 μg。 7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S3成功获得拯救病毒所用粘粒组合由分别含有BHV-1基因组1-41592 nt，54764-91064 nt，99753-135460 nt，22588-61504 nt和65620-102129 nt核苷酸序列的5个重组粘粒组成，所述BHV-1病毒全基因组序列的GeneBank登录号为NC001847。 8.权利要求1或2任一所述反向遗传操作系统的应用，其特征在于，是将反向遗传操作系统用于拯救BHV-1。 9.权利要求1或2任一所述反向遗传操作系统的应用，其特征在于，是将反向遗传操作系统用于构建BHV-1突变体或对BHV-1基因组进行修饰。 10.权利要求1或2任一所述反向遗传操作系统的应用，其特征在于，是将反向遗传操作系统用于制备牛传染性鼻气管炎重组疫苗。