ATP7B基因拷贝数变异检测用的引物和探针及试剂盒
本申请公开了一种ATP7B基因拷贝数变异检测用的引物和探针及试剂盒，所述探针包括覆盖位于ATP7B基因的21个外显子上共51个目标位点的51个探针组，所述21个外显子上共51个目标位点的位置如说明书表1中NO.1至NO.51所示；覆盖位于参照基因上至少一个目标位点的至少一个所述探针组；其中，每一所述探针组包括分别与目标位点的5’端和3’端至少部分互补的5’端探针和3’端探针；所述引物包括针对所述探针组的正向引物和反向引物。本申请能够一次性对ATP7B基因每个外显子的大片段缺失或重复进行检测，检测通量高，检测效率高，可保证检测结果的准备性，成本低，分辨率高。
发明专利
CN202311636900.0
2023-12-01
CN117551756A
2024-02-13
C12Q1/6883(2018.01)
苏州天昊医学检验实验室有限公司%天昊生物医药科技(苏州)有限公司
余锋;姜正文;张德康
215000 江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳米园B7楼501单元;
苏州三英知识产权代理有限公司
黄晨
江苏;32
1.一种ATP7B基因拷贝数变异检测用的引物和探针，其特征在于， 所述探针包括： 覆盖位于ATP7B基因的21个外显子上共51个目标位点的51个探针组，所述21个外显子上共51个目标位点的位置如说明书表1中NO.1至NO.51所示； 覆盖位于参照基因上至少一个目标位点的至少一个所述探针组； 其中，每一所述探针组包括分别与目标位点的5’端和3’端至少部分互补的5’端探针和3’端探针； 所述引物包括针对所述探针组的正向引物和反向引物。 2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，每一所述5’端探针包括依次排列的第一通用引物结合位点、第一连接序列，每一所述3’端探针包括依次排列的第二连接序列和第二通用引物结合位点，其中，所述第一连接序列和所述第二连接序列分别与目标位点的5’端和3’端至少部分互补； 所述引物包括： 针对所述第一通用引物结合位点的第一通用引物组，包括至少一个第一通用引物，每一所述第一通用引物至少与一个所述5’端探针的所述第一通用引物结合位点至少部分互补； 针对所述第二通用引物结合位点的第二通用引物组，包括至少一个第二通用引物，每一所述第二通用引物至少与一个所述3’端探针的所述第二通用引物结合位点至少部分互补。 3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，针对所述21个外显子的51个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.1～51所示，第二连接序列如SEQ ID NO.52～102所示。 4.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述探针还包括： 覆盖位于ATP7B基因上游0.5Kb处的1个目标位点的1个探针组，所述ATP7B基因上游0.5Kb处的1个目标位点的位置如说明书表1中NO.52所示，针对ATP7B基因上游的1个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.103所示，第二连接序列如SEQ ID NO.104所示； 覆盖位于ATP7B基因的3’端非翻译区的4个目标位点的4个探针组，所述ATP7B基因的3’端非翻译区的4个目标位点的位置如说明书表1中NO.53至NO.56所示，针对3’端非翻译区的4个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.105～108所示，第二连接序列如SEQ ID NO.109～112所示； 覆盖位于ATP7B基因下游200bp和500bp处的2个目标位点的2个探针组，所述ATP7B基因下游的2个目标位点的位置如说明书表1中NO.57至NO.58所示，针对ATP7B基因下游的2个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.113～114所示，第二连接序列如SEQ ID NO.115～116所示。 5.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述探针还包括： 覆盖位于X染色体上的1个目标位点的1个探针组，所述X染色体上的1个目标位点的位置如说明书表1中NO.59所示，针对X染色体的1个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.117所示，第二连接序列如SEQ ID NO.118所示； 覆盖位于Y染色体上的1个目标位点的1个探针组，所述Y染色体上的1个目标位点的位置如说明书表1中NO.60所示，针对Y染色体的1个探针组的5’端探针的第一连接序列如SEQID NO.119所示，第二连接序列如SEQ ID NO.120所示。 6.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述探针包括覆盖位于参照基因上的32个目标位点的32个探针组，所述参照基因的32个目标位点的位置如说明书表1中NO.61至NO.92所示，针对参照基因的32个探针组的第一连接序列如SEQ ID NO.121～152所示，第二连接序列如SEQ IDNO.153～184所示。 7.根据权利要求1至4任一所述的引物和探针，其特征在于，所述第一通用引物组包括四个第一通用引物，序列如SEQ ID NO.185～188所示，所述四个第一通用引物的5’端分别被不同荧光基团标记，所述第二通用引物组包括两个第二通用引物，序列如SEQ ID NO.189～190所示； 每一所述探针组的5’端探针的第一通用引物结合位点选自SEQ ID NO.191～194所示序列中的一个，每一所述探针组的3’端探针的第二通用引物结合位点选自SEQ ID NO.195～196所示序列中的一个。 8.一种ATP7B基因拷贝数变异检测用的试剂盒，其特征在于，包括 第一连接预混合液，包括4×GC Solution和探针混合液，所述探针混合液包括权利要求1至7任一所述的探针； 第二连接预混合液，包括10×Taq缓冲液和Taq连接酶； 连接反应终止液，包括EDTA； PCR预混合液，包括10×PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、引物混合液和Taq DNA聚合酶，所述引物混合液包括权利要求1至7任一所述的引物。 9.一种如权利要求8所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括： 将所述第一连接预混合液和样本DNA混合，之后加入所述第二连接预混合液进行连接反应，以使所述探针连接至目标位点； 加入所述连接反应终止液； 加入PCR预混合液，进行PCR扩增； 将扩增后的PCR产物变性后进行毛细管电泳，将扩增片段分离，得到每个所述扩增片段的信息并进行拷贝数计算。 10.根据权利要求9所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述探针包括若干探针group，每一所述探针group包括多个探针组，所述多个探针组包括至少一个针对ATP7B基因的检测探针组以及至少一个针对参照基因的参照探针组，且每一所述探针group的多个所述探针组对应于相同的正向引物和反向引物； 所述得到每个所述扩增片段的信息并进行拷贝数计算的步骤包括： 将所述探针group内的一检测探针组a对应的扩增片段的荧光峰高值除以同一探针group内的一参照探针组b对应的扩增片段的荧光峰高值，得到所述检测探针组a的R值； 将检测样本中所述检测探针组a的R值分别除以n个正常参照样本中所述检测探针组a的R值再乘以正常参照样本中所述检测探针组a的拷贝数，得到所述检测探针组a针对所述参照探针组b的n个校正拷贝数值，其中，所述检测样本为待检测ATP7B基因拷贝数的样本，所述正常参照样本为已知ATP7B基因拷贝数正常的样本； 当n大于1时，计算所述n个校正拷贝数值的平均值、标准方差及变异系数，若所述n个校正拷贝数值的变异系数小于10％，取所述n个校正拷贝数值的平均值作为所述检测探针组a针对所述参照探针组b的相对拷贝数； 若所述n个校正拷贝数值的变异系数大于10％，则依次剔除离所述n个校正拷贝数值的中位数最远的校正拷贝数值，直至剩余的m个校正拷贝数值的变异系数小于5％，其中，m大于或等于2n/3，取所述m个校正拷贝数值的平均值作为所述检测探针组a针对所述参照探针组b的相对拷贝数； 若不存在剩余的m个校正拷贝数值的变异系数小于5％，则取所述n个校正拷贝数值的中位数作为所述检测探针组a针对所述参照探针组b的相对拷贝数； 重复上述步骤，分别计算所述检测探针组a针对同一探针group内所有参照探针组的相对拷贝数，得到所述检测探针组a的i个相对拷贝数； 计算所述i个相对拷贝数的平均值、标准方差及变异系数，若所述i个相对拷贝数的变异系数小于10％，取所述i个相对拷贝数的平均值作为所述检测探针组a对应的扩增片段的拷贝数； 若所述i个相对拷贝数的变异系数大于10％，则依次剔除离所述i个相对拷贝数的中位数最远的相对拷贝数，直至剩余的j个相对拷贝数的变异系数小于5％，其中，j大于或等于2n/3，取所述j个相对拷贝数的平均值作为所述检测探针组a对应的扩增片段的拷贝数； 若不存在剩余的j个相对拷贝数的变异系数小于5％，则取所述i个相对拷贝数的中位数作为所述检测探针组a对应的扩增片段的拷贝数。