2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因及其表达蛋白和应用
本发明公开了2,4‑二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因及其表达蛋白和应用，属于基因工程技术领域。本发明的2,4‑二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明构建了2,4‑二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体，将所构建的重组表达载体转化到大肠杆菌中，构建重组大肠杆菌表达菌株E. coli BL21 pET28a(+)‑T7‑ectB‑T7ter‑T7‑ectAm‑T7ter‑T7‑ectC‑T7ter。重组大肠杆菌表达菌株产四氢嘧啶的浓度为67.86±1.76 g/L。
发明专利
CN202311473002.8
2023-11-07
CN117187274A
2023-12-08
C12N15/54(2006.01)
江苏省中国科学院植物研究所
周正雄;汪仁;高萌;徐晟;李洁;孙彬;张越
210014 江苏省南京市玄武区前湖后村1号
南京智转慧移知识产权代理有限公司
王伟
江苏;32
1.2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 2.权利要求1所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 3.含有权利要求1所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体、宿主菌。 4.根据权利要求3所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm- T7ter-T7-ectC-T7ter，其表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。 5.权利要求3所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于，步骤如下： 1）设计引物F2、R2，序列分别如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以GenBank: FN869568.2为模版扩增获得ectB的基因片段； 设计引物F3、R3，序列分别如SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7启动子的基因片段； 设计引物F4、R4，序列分别如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7终止子的基因片段； 将ectB的基因片段、T7启动子的基因片段、T7终止子的基因片段使用Gibbson组装，获得2,4-二氨基丁酸转移酶基因的表达框T7-ectB-T7ter； 2）设计引物F5、R5，序列分别如SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以SEQ ID NO. 1为模版扩增获得ectAm的基因片段； 设计引物F6、R6，序列分别如SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7启动子的基因片段； 设计引物F7、R7，序列分别如SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7终止子的基因片段； 将ectAm的基因片段、T7启动子的基因片段、T7终止子的基因片段使用Gibbson组装，获得2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的表达框T7-ectAm-T7ter； 3）设计引物F8、R8，序列分别如SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 17所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以GenBank: FN869568.2为模版扩增获得ectC的基因片段； 设计引物F9、R9，序列分别如SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 19所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7启动子的基因片段； 设计引物F10、R10，序列分别如SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 21所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7终止子的基因片段； 将ectC的基因片段、T7启动子的基因片段、T7终止子的基因片段使用Gibbson组装，获得四氢嘧啶合成酶基因的表达框T7-ectC-T7ter； 4）设计引物F11、R11，序列分别如SEQ ID NO. 22和SEQ ID NO. 23所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得pET28a(+)质粒片段，将pET28a(+)质粒片段与T7-ectB-T7ter经Gibbson组装，获得表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter； 以表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter为模版，经BamH I和EcoR Ⅰ酶切后，与基因表达框T7-ectAm-T7ter经BamH I 和EcoR Ⅰ 酶切后的片段，利用T4连接酶进行连接获得表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter- T7-ectAm-T7ter； 以pET28a(+)-T7-ectB-T7ter- T7-ectAm-T7ter为模版，经Sal Ⅰ 和Hind Ⅲ 酶切后，与基因表达框T7-ectC-T7ter经Sal Ⅰ 和Hind Ⅲ 酶切后的片段，利用T4连接酶进行连接获得表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter- T7-ectAm-T7ter-T7-ectC- T7ter。 6.权利要求1所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因或权利要求2所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的表达蛋白在制备四氢嘧啶中的应用。 7.根据权利要求6所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因在制备四氢嘧啶中的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1）构建2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体； 2）将所构建的2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体转化到大肠杆菌E. coli BL21中，构建获得重组大肠杆菌表达菌株； 3）挑取重组大肠杆菌表达菌株接种于LB培养基培养获得种子液将种子液接种到发酵培养基中，培养至OD600 nm为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，诱导24h后，8000rpm，4℃离心5min，收集上清，获得含有四氢嘧啶的发酵液。 8.根据权利要求7所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因在制备四氢嘧啶中的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为： 每升培养基中含5-40g酵母粉，5-20g蛋白胨，2-15g磷酸氢二钾，0.5-6g磷酸二氢钾和10-80mL甘油； 或为：每升培养基中含5-40g酵母粉，5-20g蛋白胨，2-15g磷酸氢二钾，0.5-6g磷酸二氢钾和20-100g葡萄糖。 9.根据权利要求7所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因在制备四氢嘧啶中的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌表达菌株为E. coli BL21 pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter。 10.权利要求3所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体或权利要求9所述重组大肠杆菌表达菌株E. coliBL21 pET28a(+)-T7-ectB- T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter在制备四氢嘧啶中的应用。