3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法
本发明涉及3’‑氨基‑2’,3’‑双脱氧鸟苷5’‑三磷酸的合成方法，涉及寡核苷类药物技术领域，包括以下步骤：核苷激酶催化3’‑氨基‑双脱氧鸟苷生成3’‑氨基‑双脱氧鸟苷‑5’‑单磷酸；核苷酸激酶催化3’‑氨基‑双脱氧鸟苷‑5’‑单磷酸生成3’‑氨基‑双脱氧鸟苷‑5’‑二磷酸；3’‑氨基‑双脱氧鸟苷‑5’‑二磷酸在乙酸激酶AcK、ATP和二价金属离子的作用下上磷酸生成3’‑氨基‑2’,3’‑双脱氧鸟苷5’‑三磷酸；且整个过程使用ATP脱磷酸生成ADP，乙酸激酶AcK催化乙酰磷酸脱磷酸生成乙酸供磷酸给ADP生成ATP。本发明提供的使用一步酶法制备，具有操作简单、生产成本低等优点，填补了生物酶法合成3’‑NH2‑ddGTP的空白。
发明专利
CN202311414822.X
2023-10-30
CN117143942A
2023-12-01
C12P19/32(2006.01)
泰兴合全药业有限公司%常州合全药业有限公司
黄月园;李杰;张艺;张波琨;卞琪;孙丰来
225400 江苏省泰州市泰兴市经济开发区天星大道18号;
天津垠坤知识产权代理有限公司
王忠玮
1.一种3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法，其特征在于，包括以下步骤： S1. 核苷激酶催化3’-氨基-双脱氧鸟苷生成3’-氨基-双脱氧鸟苷-5’-单磷酸； S2. 核苷酸激酶催化3’-氨基-双脱氧鸟苷-5’-单磷酸生成3’-氨基-双脱氧鸟苷-5’-二磷酸； S3. 3’-氨基-双脱氧鸟苷-5’-二磷酸在乙酸激酶AcK、ATP和二价金属离子的作用下上磷酸生成3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸； 且整个过程使用ATP脱磷酸生成ADP，乙酸激酶AcK催化乙酰磷酸脱磷酸生成乙酸供磷酸给ADP生成ATP。 2.根据权利要求1所述的3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法，其特征在于：步骤S1中的核苷激酶来源于Escherichia coli E1728的鸟苷激酶，所述鸟苷激酶经过基因重组，在重组载体中表达，并经过细胞破碎，离心过滤后冻干即得核苷激酶；所述核苷激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。 3.根据权利要求1所述的3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法，其特征在于：步骤S2中的核苷酸激酶来源于Escherichia coli ATCC 8739鸟苷酸激酶，所述鸟苷酸激酶经过基因重组，在重组载体中表达，并经过细胞破碎，离心过滤后冻干即得核苷酸激酶；所述核苷酸激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。 4.根据权利要求1所述的3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法，其特征在于：步骤S3中的乙酸激酶来源于Thermotoga maritima，Thermotoga maritima经过基因重组，在重组载体中表达，并经过细胞破碎，离心过滤后冻干即得乙酸激酶；所述乙酸激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。 5.根据权利要求1所述的3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法，其特征在于：催化转化过程的pH为6.0~9.0、温度为30℃~40℃、反应时间为2~28h。 6.根据权利要求1所述的3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法，其特征在于： ATP浓度为1~20mmol/L；二价金属离子的浓度为1mmol/L~20mmol/L；乙酰磷酸浓度为1~200mmol/L； 且每0.5~40ml体积反应体系中，3’ -氨基-双脱氧鸟苷的添加量为0.2~20mg，核苷激酶、核苷酸激酶和乙酸激酶的添加量为0.02~1mg。 7.根据权利要求6所述的3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法，其特征在于：二价金属离子为锰离子、镁离子、钴离子、锌离子、锰离子中的任意一种或多种组合。 8.根据权利要求1所述的3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法，其特征在于：整个反应体系为水性体系。 9.根据权利要求8所述的3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法，其特征在于：水性体系含有缓冲液，所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液或三羟甲基甲胺盐缓冲液。 10.根据权利要求9所述的3’-氨基-2’,3’-双脱氧鸟苷5’-三磷酸的合成方法，其特征在于：缓冲液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液，浓度为10~200mol/L。