ANK1基因c.5096G>A（p.R1733K）点突变的小鼠模型构建及其应用
本申请涉及一种ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型构建以及应用。以研究不同基因型的小鼠外周血的红细胞形态变化为特征，采用CRISPR/Cas9技术介导同源重组修复的方式引入目的点突变，构建ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型。在获得ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的转基因小鼠后，对外周血的检测进一步说明ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变与遗传性球形红细胞增多症有密不可分的联系。
发明专利
CN202311372218.5
2023-10-23
CN117265019A
2023-12-22
C12N15/89(2006.01)
台州市中心医院(台州学院附属医院)
陈光;徐玲珑;丁晓飞;卢洪胜;陈洁;高竞雯;钟正扬;蔡梓浩;周思赟;朱波
318000 浙江省台州市椒江区经济开发区东海大道999号
杭州品众专利代理事务所(特殊普通合伙)
袁康杰
浙江;33
1.ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一：ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型构建； 步骤二：ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠后代繁殖； 步骤三：ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的后代小鼠基因鉴定，获取ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型。 2.根据权利要求1所述的ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤一：ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型构建，包括： 步骤1-1，通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和guideRNA，通过合成获得oligodonor DNA； 步骤1-2，将Cas9 mRNA、gRNA和donor DNA显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠； 步骤1-3，PCR产物测序阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配，共获得3只ANK1基因R1733K点突变阳性F1代小鼠。 3.根据权利要求1所述的ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤二：ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠后代繁殖： 步骤2-1，将步骤1-3获得的3只ANK1基因R1733K点突变阳性F1代小鼠进行分笼，一只ANK1基因R1733K点突变阳性杂合子雄性小鼠与一只ANK1基因R1733K点突变阳性杂合子雌性小鼠一笼； 步骤2-2，将步骤1-3获得的1只ANK1基因R1733K点突变阳性雄性小鼠与3只野生型雌性小鼠一笼。 4.根据权利要求1所述的ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤三：ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的后代小鼠基因鉴定，包括： 步骤3-1，将新出生2周的小鼠进行剪脚趾标记序号； 步骤3-2，剪取小鼠的耳朵进行DNA抽提； 步骤3-3，将提取DNA进行PCR扩增； 步骤3-4，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳； 步骤3-5，将PCR产物进行纯化并测序，根据测序结果，筛选得到ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型。 5.一种ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型，采用权利要求1-4中任一项所述构建ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型的构建方法得到。 6.一种权利要求5所述的ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型，在基因突变疾病中的研究/应用。 7.一种权利要求5所述的ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变的小鼠模型，在遗传性球形红细胞增多症中，研究/应用ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变与遗传性球形红细胞增多症的关系。 8.根据权利要求7所述的研究/应用，其特征在于，包括如下步骤： 步骤4-1，根据测序结果将不同的类型的小鼠进行分类，分为纯合子组，杂合子组，野生型组； 步骤4-2，在小鼠眼眶静脉丛采取300-500uL外周血并储存在枸橼酸钠采血管内，并进行血常规和血涂片检测； 步骤4-3，根据血常规和血涂片检测结果，对比平均红细胞宽度和平均红细胞体积，并判断ANK1基因c.5096G>A(p.R1733K)点突变与遗传性球形红细胞增多症的关系。