17型人源化胶原蛋白及其蛋白支架、填充材料及应用
本发明涉及17型人源化胶原蛋白技术领域，具体涉及17型人源化胶原蛋白及其蛋白支架、填充材料及应用。利于17人源化胶原蛋白的目的基因进行体外重组表达，构建了重组表达载体和基因工程菌株。该基因工程菌株在甲醇诱导下能够于胞外高效表达17型人源化胶原蛋白，便于大规模收获和制备该种重组17型人源化胶原蛋白。利用该17型人源化胶原蛋白制备成了一种三维大孔支架。该种三维大孔支架具有良好的生物相容性和机械性能，具有作为体内填充材料的应用前景。
发明专利
CN202311242638.1
2023-09-25
CN117230103A
2023-12-15
C12N15/81(2006.01)
广东瀚润生物科技有限公司
李锦行
511500 广东省清远市清城区石角镇广州(清远)产业转移工业园广州路10-2号
广东;44
1.一种重组表达17人源化胶原蛋白的表达载体，其携带有如SEQ ID NO.1所示的目的基因。 2.一种如权利要求1所述的表达载体的构建方法，其包括：将 pPIC9K 及 PCR 扩增产物片段 COL3-17，使用Hi Fi DNA Assembly Cloning Kit 试剂盒将酶切产物与PCR 扩增产物连接，将连接产物转化至大肠杆菌Match1 T1 感受态细胞内，在含有氨苄青霉素（100μg/mL）的 LB 固体平板上生长，挑取单克隆，pPIC9K 通用引物 PCR 鉴定是否含有目的基因，从单克隆菌株中提取所述表达载体。 3.一种重组17人源化胶原蛋白的基因工程菌株，其为转入了权利要求1所述表达载体的毕赤酵母。 4.一种如权利要求3所述的重组17人源化胶原蛋白工程菌株的构建方法，其包括：将所述表达载体pPIC9K-COL17使用限制性内切酶SalⅠ线性化，回收片段，通过电转法转化至毕赤酵母 GS115 感受态中，涂布于MD 固体平板上，30 ℃静置培养 2 d，得到组氨酸回补的阳性转化子；挑取阳性转化子，在沸水和液氮中反复冻融三次，粗提得到基因组，使用pPIC9K的通用引物 a-factor/3AOX1 进行 PCR 鉴定，筛选得到重组工程菌株GS115/pPIC9K-COL17。 5.一种重组17人源化胶原蛋白的制备方法，其包括： 制备如权利要求1所述的表达载体； 根据所述表达载体制备如权利要求3所述的基因工程菌株； 将所述基因工程菌株接种至YPD培养基中并补充甲醇至0.5%诱导发酵； 收获发酵上清液，经亲和层析收获目的蛋白。 6.权利要求5所述的制备方法制得的重组17人源化胶原蛋白。 7.一种三维大孔蛋白支架的构建方法，其包括： 将50目石蜡微球加入模具中，移入预热的烘箱中在50℃加热60min后室温冷却； 用蒸馏水将如权利要求6所述的重组17型人源胶原蛋白配制成10%的溶液； 用蒸馏水将丝素蛋白分别配制成10%溶液； 用蒸馏水将纳米级羟基磷灰石粉末制成10%的匀浆溶液； 将上述3种液体按照等体积混合，在超声振荡器中混匀后加到模具中，真空抽吸后移入-80℃冰箱4h，在无水乙醇中浸泡2h使蛋白结晶，以正己烷提取石蜡微球后剩余的即为三维大孔支架。 8.权利要求7所述的制备方法制得的蛋白支架。 9.权利要求7所述的制备方法制得的填充材料。 10.权利要求6所述的重组17人源化胶原蛋白在医用填充材料中的应用。