admX基因作为正调控因子在提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的应用
本发明公开了提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的方法，包括：1)定向敲除桃色欧文氏菌基因组上的admX基因，构建得到admX敲除的桃色欧文氏菌菌株BKOX，admX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；2)将admX基因过表达质粒转入admX敲除的桃色欧文氏菌菌株BKOX中，构建得到工程菌桃色欧文氏菌BKOX‑XP；3)将工程菌桃色欧文氏菌BKOX‑XP接种于液体培养基中培养，获取发酵液，从发酵液中收集安吉菌素。本发明还公开了桃色欧文氏菌admX基因作为正调控因子在提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的应用。本发明安吉菌素产量与野生型相比提高了260％，处于目前现有报道中的高水平行列。
发明专利
CN202310731643.2
2023-06-20
CN116790651A
2023-09-22
C12N15/74(2006.01)
中国科学院天津工业生物技术研究所
赵磊;赵伦强;葛同玲;程庭峰
300308 天津市滨海新区空港经济区西七道32号
北京远大卓悦知识产权代理有限公司
靳雪华
天津;12
1.一种提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)定向敲除桃色欧文氏菌基因组上的admX基因，构建得到admX敲除的桃色欧文氏菌菌株BKOX，其中，所述admX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示； (2)将admX基因过表达质粒转入admX敲除的所述桃色欧文氏菌菌株BKOX中，构建得到工程菌桃色欧文氏菌BKOX-XP； (3)将工程菌桃色欧文氏菌BKOX-XP接种于液体培养基中培养，获取发酵液，从发酵液中收集安吉菌素。 2.如权利要求1所述的提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的方法，其特征在于，步骤1)中，所述桃色欧文氏菌采用桃色欧文氏菌BST187。 3.如权利要求1所述的提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的方法，其特征在于，步骤3)中，所述液体培养基为LB培养基。 4.如权利要求1所述的提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的方法，其特征在于，步骤3)中，发酵时间为12-24小时，发酵温度为28℃。 5.如权利要求1至4任一项所述的提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的方法，其特征在于，步骤1)中，定向敲除桃色欧文氏菌基因组上的admX基因，构建得到admX敲除的桃色欧文氏菌菌株BKOX包括如下步骤： (1.1)将第二筛选元件sacB重组到包含第一筛选元件R6Kγ-ori的自杀质粒pKNOCK-Km中得到重组自杀载体pKNOCK-sacB-Km； (1.2)以桃色欧文氏菌BST187菌液为模板，分别以如SEQ ID NO:6和7所示的一组引物对和如SEQ ID NO:8和9所示的一组引物对为引物，通过PCR扩增桃色欧文氏菌BST187基因组上admX的基因片段，作为admX敲除载体的上游同源臂和下游同源臂， 将重组自杀载体pKNOCK-sacB-Km的基因片段与所述admX敲除载体的上游同源臂和下游同源臂的基因片段通过同源重组的方法进行连接，得到admX敲除载体pKNOCK-sacB-Km-admX； (1.3)将所述admX敲除载体pKNOCK-sacB-Km-admX转到大肠杆菌S17-1λpir感受态细胞中，作为敲除载体pKNOCK-sacB-Km-admX供体菌， (1.4)取桃色欧文氏菌BST187作为受体菌，将所述敲除载体pKNOCK-sacB-Km-admX供体菌和受体菌桃色欧文氏菌BST187混合后通过细菌接合作用进行基因交换，依次利用第一筛选元件和第二筛选元件筛选交换成功的菌株，得到admX敲除成功的菌株，命名为所述桃色欧文氏菌菌株BKOX。 6.如权利要求1至4任一项所述的提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的方法，其特征在于，步骤2)中，所述admX基因过表达质粒的构建包括如下步骤： 以桃色欧文氏菌BST187的菌悬液为模板，分别以SEQ ID NO:16和17所示的一组引物对和如SEQ ID NO:18和19所示的一组引物对分别通过PCR扩增得到含有自身启动子Pgap-1的admX基因片段， 以载体pET28a为模板，以如SEQ ID NO:20和21所示的一组引物对通过PCR扩增获得线性化的pET28a载体片段； 将含有自身启动子Pgap-1的admX基因片段和线性化的pET28a载体片段进行同源重组，得到重组产物，然后将重组产物转化大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，获得含有自身启动子Pgap-1的admX过表达质粒pET28a-Pgap-1::admX。 7.如权利要求5所述的提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的方法，其特征在于，步骤1.1)中，以自杀质粒pKNOCK-Km为模板，以SEQ ID NO:2和3所示的一组引物对通过PCR扩增得到含有R6Kγ-ori元件的自杀质粒pKNOCK-Km基因片段， 以pK18mobsacB敲除载体为模板，以SEQ ID NO:4和5所示的一组引物对通过PCR扩增得到所述sacB元件的基因片段， 将含有R6Kγ-ori元件的自杀质粒pKNOCK-Km基因片段与所述sacB元件的基因片段通过同源重组的方法进行连接，得到pKNOCK-sacB-Km重组自杀载体。 8.桃色欧文氏菌admX基因作为正调控因子在提高桃色欧文氏菌合成安吉菌素产量的应用，其特征在于，所述admX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。