2ODD蛋白、基因、载体、细胞、组合物及其应用
本发明涉及基因工程领域，公开了一种2ODD蛋白、基因、载体、细胞、组合物及应用、提高作物除草剂抗性的方法，具体地，公开了一种2ODD蛋白、一种编码2ODD蛋白的基因、一种重组载体、一种转基因细胞、一种组合物以及它们在提高作物除草剂抗性中的应用，还公开了提高作物除草剂抗性的方法。本发明提供的2ODD蛋白及其编码基因能够用于提高作物对HPPD抑制剂的抗性。
发明专利
CN202310502130.4
2023-05-06
CN117004583A
2023-11-07
C12N9/02(2006.01)
华中师范大学
杨光富;林红艳;董进;叶宝琴
430079 湖北省武汉市洪山区珞喻路152号
北京润平知识产权代理有限公司
陈静
湖北;42
1.一种Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶蛋白，其特征在于，具有选自以下至少一种的氨基酸序列： (1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中141位点和205位点中的至少一个位点发生突变后衍生的第一氨基酸序列； (2)所述第一氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由第一氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第一氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质； (3)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中选自140位点、204位点、298位点和335位点中的至少3个位点发生突变后衍生的第二氨基酸序列； (4)所述第二氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由第二氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第二氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质； (5)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中选自206位点、301位点和339位点中的至少一个位点发生突变后衍生的第三氨基酸序列； (6)所述第三氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由第三氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第三氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质； (7)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中选自142位点、207位点和301位点中的至少一个位点发生突变后衍生的第四氨基酸序列； (8)所述第四氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由第四氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第四氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质； (9)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中选自285位点和322位点中的至少一个位点发生突变后衍生的第五氨基酸序列； (10)所述第五氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由第五氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第五氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质； (11)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列中选自142位点、207位点、301位点和338位点中的至少一个位点发生突变后衍生的第六氨基酸序列； (12)所述第六氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由第六氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第六氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质； (13)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中选自140位点、205位点和336位点中的至少2个位点发生突变后衍生的第七氨基酸序列； (14)所述第七氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由第七氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第七氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质； (15)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列中选自140位点、205位点和336位点中的至少2个位点发生突变后衍生的第八氨基酸序列； (16)所述第八氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的由第八氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第八氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质。 2.根据权利要求1所述的Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶蛋白，其中，所述第一氨基酸序列为选自以下至少一种的氨基酸序列： (1a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中141位点的组氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； (1b)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中141位点的组氨酸突变为苯丙氨酸且205位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸后衍生的氨基酸序列； 优选地，所述第一氨基酸序列为H141F、H141F/F205L所示的氨基酸序列； 优选地，所述第二氨基酸序列为以下的氨基酸序列： (2a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中140位点的苯丙氨酸突变为组氨酸、204位点的亮氨酸突变为苯丙氨酸、298位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸且335位点的异亮氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； (2b)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中204位点的亮氨酸突变为苯丙氨酸、298位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸且335位点的异亮氨酸突变为丙氨酸后衍生的氨基酸序列； (2c)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中204位点的亮氨酸突变为苯丙氨酸、298位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸且335位点的异亮氨酸突变为色氨酸后衍生的氨基酸序列； 优选地，所述第二氨基酸序列为F140H/L204F/F298L/I335F、L204F/F298L/I335A、L204F/F298L/I335W所示的氨基酸序列中的至少一种；优选地，所述第三氨基酸序列为以下的氨基酸序列： (3a)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中206位点的苏氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； (3b)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中206位点的苏氨酸突变为苯丙氨酸且301位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸后衍生的氨基酸序列； (3c)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中206位点的苏氨酸突变为苯丙氨酸、301位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸且339位点的酪氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； 优选地，所述第三氨基酸序列为T206F、T206F/F301L、T206F/F301L/Y339F所示的氨基酸序列中的至少一种； 优选地，所述第四氨基酸序列为以下的氨基酸序列： (4a)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中142位点的酪氨酸突变为组氨酸后衍生的氨基酸序列； (4b)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中142位点的酪氨酸突变为组氨酸且207位点的异亮氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； (4c)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中142位点的酪氨酸突变为组氨酸、207位点的异亮氨酸突变为苯丙氨酸且301位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸后衍生的氨基酸序列； 优选地，所述第四氨基酸序列为Y142H、Y142H/I207F、Y142H/I207F/F301L所示的氨基酸序列中的至少一种； 优选地，所述第五氨基酸序列为以下的氨基酸序列： (5a)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中285位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸后衍生的氨基酸序列； (5b)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中285位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸且322位点的组氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； 优选地，所述第五氨基酸序列为F285L、F285L/H322F所示的氨基酸序列中的至少一种； 优选地，所述第六氨基酸序列为以下的氨基酸序列： (6a)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列中142位点的谷氨酰胺突变为组氨酸后衍生的氨基酸序列； (6b)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列中142位点的谷氨酰胺突变为组氨酸且207位点的异亮氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； (6c)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列中142位点的谷氨酰胺突变为组氨酸、207位点的异亮氨酸突变为苯丙氨酸且301位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸后衍生的氨基酸序列； (6d)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列中142位点的谷氨酰胺突变为组氨酸、207位点的异亮氨酸突变为苯丙氨酸、301位点的苯丙氨酸突变为亮氨酸且338位点的精氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； (6e)如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列中142位点的谷氨酰胺突变为组氨酸且338位点的精氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； 优选地，所述第六氨基酸序列为Q142H、Q142H/I207F、Q142H/I207F/F301L、Q142H/I207F/F301L/R338F、Q142H/R338F所示的氨基酸序列中的至少一种； 优选地，所述第七氨基酸序列为以下的氨基酸序列： (7a)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中140位点的谷氨酰胺突变为组氨酸且205位点的酪氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； (7b)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中140位点的谷氨酰胺突变为组氨酸、205位点的酪氨酸突变为苯丙氨酸且336位点的赖氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； 优选地，所述第七氨基酸序列为Q140H/Y205F、Q140H/Y205F/K336F所示的氨基酸序列中的至少一种； 优选地，所述第八氨基酸序列为以下的氨基酸序列： (8a)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列中140位点的谷氨酰胺突变为组氨酸且205位点的酪氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； (8b)如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列中140位点的谷氨酰胺突变为组氨酸、205位点的酪氨酸突变为苯丙氨酸且336位点的赖氨酸突变为苯丙氨酸后衍生的氨基酸序列； 优选地，所述第八氨基酸序列为Q140H/Y205F、Q140H/Y205F/K336F所示的氨基酸序列中的至少一种。 3.一种编码Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为能够编码权利要求1或2所述的Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列； 优选地，该基因的核苷酸序列为选自以下至少一种的核苷酸序列： (1)如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列； (2)与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列； (3)如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列； (4)与SEQ ID NO:21具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列； (5)如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列； (6)与SEQ ID NO:31具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列； (7)如SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列； (8)与SEQ ID NO:41具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列； (9)如SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列； (10)与SEQ ID NO:51具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列； (11)如SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列； (12)与SEQ ID NO:61具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列； (13)如SEQ ID NO:71所示的核苷酸序列； (14)与SEQ ID NO:71具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列； (15)如SEQ ID NO:81所示的核苷酸序列； (16)与SEQ ID NO:81具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列。 4.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求3所述的基因。 5.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求3所述的基因； 优选地，所述转基因细胞为原核细胞。 6.一种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1或2所述的Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶蛋白。 7.权利要求1或2所述的Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶蛋白、权利要求3所述的基因、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的转基因细胞中的至少一种在提高作物除草剂抗性中的应用； 优选地，所述除草剂为HPPD抑制剂； 优选地，所述除草剂为三酮类化合物、吡唑类化合物、异噁唑类化合物、二酮腈类化合物和杂环酰胺类化合物中的至少一种； 更优选地，所述除草剂为硝磺草酮、环磺酮、呋喃磺草酮、双环磺草酮原药、喹草酮、甲基喹草酮、Y18024、Y16550和苯吡唑草酮中的至少一种。 8.一种提高作物除草剂抗性的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求4所述的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达权利要求1或2所述的Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。 9.一种提高作物除草剂抗性的方法，其特征在于，该方法包括：通过杂交、转育或回交，将含有权利要求4所述的重组载体的突变作物中的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达权利要求1或2所述的Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。 10.一种提高作物除草剂抗性的方法，其特征在于，该方法包括：通过CRISPR/Cas基因编辑方法对目标植物的HIS1/HSL基因进行改造，使得目标植物表达权利要求1或2所述的Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。