5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途和基因编辑系统及其编辑方法
本发明涉及一种5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途和基因编辑系统及其编辑方法。所述5’→3’核酸外切酶与所述基因编辑系统中的位点特异性核酸酶为非融合状态；所述基因编辑系统包含：位点特异性核酸酶、5’→3’核酸外切酶和供体DNA，其中，所述5’→3’核酸外切酶与所述位点特异性核酸酶为非融合状态。本发明通过将5’→3’核酸外切酶引入基因编辑系统中，能够提高精准基因编辑效率。
发明专利
CN202310233884.4
2023-03-03
CN116286741A
2023-06-23
C12N9/22(2006.01)
清华大学
李寅青;王沛喆;富晶晶
100084 北京市海淀区清华园1号
北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)
黄德海
北京;11
1.一种5’→3’核酸外切酶在基因编辑系统中的用途，其特征在于，所述5’→3’核酸外切酶与所述基因编辑系统中的位点特异性核酸酶为非融合状态。 2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因编辑系统中采用的细胞为动物细胞，优选为哺乳动物细胞； 任选地，所述述5’→3’核酸外切酶为T7核酸外切酶； 任选地，所述T7核酸外切酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。 3.一种基因编辑系统，其特征在于，包含： 位点特异性核酸酶、5’→3’核酸外切酶和供体DNA； 其中，所述5’→3’核酸外切酶与所述位点特异性核酸酶为非融合状态。 4.根据权利要求3所述的基因编辑系统，其特征在于，所述5’→3’核酸外切酶为T7核酸外切酶； 任选地，所述T7核酸外切酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。 5.根据权利要求3或4所述的基因编辑系统，其特征在于，所述位点特异性核酸酶选自成簇规律间隔短回文重复、转录激活样效应因子核酸酶、锌指核酸酶、归巢内切酶、限制性核酸内切酶中的至少之一； 任选地，所述位点特异性核酸酶的添加量为2～50ng； 任选地，所述5’→3’核酸外切酶的添加量为40～120ng； 任选地，所述供体DNA的添加量为0.2～100ng。 6.根据权利要求5所述的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统进一步包含：gRNA； 任选地，所述gRNA包括选自sgRNA、pegRNA和crRNA/tracrRNA中的至少之一； 任选地，所述基因编辑系统进一步包含：招募系统； 任选地，若所述招募系统为MS2/MCP系统，所述gRNA为gRNA-MS2或pegRNA-MS2，所述5’→3’核酸外切酶为MCP-外切酶融合蛋白； 任选地，所述供体DNA为采用硫代磷酸二酯键修饰的线性双链DNA和/或HMEJ形式的环状双链DNA； 任选地，所述供体DNA上的所述硫代磷酸二酯键的修饰个数大于2，优选为4-10。 7.根据权利要求3或4所述的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统的技术路线包括寡核苷酸编辑模板介导的同源重组、单碱基编辑、引导编辑和双链长链核酸编辑模板介导的同源重组中的一种。 8.一种对细胞进行基因编辑的方法，其特征在于，包括： 将权利要求3-7任一项所述的基因编辑系统引入细胞。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞为动物细胞，优选为哺乳动物细胞。 10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述细胞为终末分化原代细胞。