7-DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌及其构建与应用
本发明涉及一种7‑DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌株，及其构建方法和应用。本发明构建了一株可向胞外高效转运7‑DHC的重组S.cerevisiae菌株sc13，利用其进行500mL摇瓶双相发酵时，7‑DHC总产量达到28.189mg/g(分泌量11.701mg/g)，相较于对照sc1菌株，7‑DHC总产量提升14.54倍，胞外总分泌量提升13.77倍，其中胞外7‑DHC的分泌产量占比41.51％。由本发明构建的重组菌株具有更强的外分泌能力和更高的产量，对7‑DHC的合成以及简化7‑DHC的分离提取提供了指导思路，具有广阔的应用前景。
发明专利
CN202310058515.6
2023-01-18
CN116179384A
2023-05-30
C12N1/19(2006.01)
浙江工业大学
柳志强;柯霞;潘子豪;杜宏斐;郑裕国
310000 浙江省杭州市拱墅区潮王路18号
浙江千克知识产权代理有限公司
冷红梅
浙江;33
1.一种7-DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌，由如下方法构建获得：将底盘菌酿酒酵母基因组强化表达截短3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、角鲨烯环氧酶ERG1、NADH激酶POS5、羊毛甾醇去甲基化酶ERG11、角鲨烯合酶ERG9、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1、磷酸戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸激酶ERG12、法尼基焦磷酸合酶ERG20、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶ERG19，并异源表达Gallus Gallus来源的24-甾醇还原酶DHCR24，敲除麦角固醇合成所需的C-22甾醇去饱和酶ERG5、半乳糖/乳糖代谢调节蛋白GAL80以及在GAL4系统中充当抑制因子的半胱氨酸蛋白酶GAL6和MIG1，敲除NADP+特异性谷氨酸脱氢酶GDH1,敲除二酰基甘油焦磷酸磷酸酶DPP1，敲除能将醇类脱氢的酶ADH3，并异源表达甾醇转运蛋白ST1和PR-1，获得所述7-DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌。 2.如权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于所述底盘菌为酿酒酵母CEN.PK2-1C。 3.如权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：通过PGAP启动子强化表达tHMG1，通过PGAL2启动子强化表达ERG1，通过PGAL1启动子强化表达ERG11，通过PGAL1启动子强化表达POS5，通过PGAL1，10双向启动子强化表达ERG8和ERG12，通过PGAL1，10双向启动子强化表达ERG20和ERG9，通过PGAL1，10双向启动子强化表达IDI1和ERG19，通过PGAP启动子异源表达DHCR24，通过PGAL1启动子异源表达ST1和PR-1。 4.构建权利要求1所述酿酒酵母基因工程菌的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤： (1)敲除麦角固醇合成所需的C-22甾醇去饱和酶ERG5，并将PGAP-DHCR24-TCYC1片段整合到酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组上的ERG5酶位点，构建得到的酿酒酵母命名为sc1菌株； (2)将PGAL2-ERG1-TCYC1片段整合至sc1菌株基因组上，整合至GAL6位点，构建得到酿酒酵母命名为sc2菌株； (3)将PGAL1-tHMG-TCYC1片段整合至sc2菌株基因组上Ty1两端的δ序列中，构建得到酿酒酵母菌株命名为sc3菌株； (4)将TTEF-TADH1-ERG8-PGAL10-PGAL1-ERG12-TCYC1片段整合至sc3菌株基因组上的GAL80酶位点，构建得到酿酒酵母菌株命名为sc4菌株； (5)将TTEF-PGAL1-POS5-TCYC1片段整合至sc4菌株基因组上的MIG1位点，构建得到酿酒酵母菌株命名为sc5菌株； (6)将TTEF-TADH1-ERG9-PGAL10-PGAL1-ERG20-TCYC1片段整合至sc5菌株基因组上的DPP1位点，构建得到酿酒酵母菌株命名为sc6菌株； (7)将TTEF-PGAL1-ERG11-TCYC1片段整合至sc6菌株基因组上的GDH1位点，构建得到酿酒酵母菌株命名为sc7菌株； (8)将TTEF-TADH1-IDI1-PGAL10-PGAL1-ERG19-TCYC1片段整合至sc7菌株基因组上的ADH3位点，构建得到酿酒酵母菌株命名为sc8菌株； (9)将PGAL1-DHCR24-TCYC1片段整合至sc8菌株基因组上的Ty3位点，构建得到酿酒酵母菌株命名为sc9菌株； (10)将H1-PGAL1-ST1-PGAL1-PR1-H2导入sc9菌株基因组，构建得到酿酒酵母菌株命名为sc13菌株，即所述7-DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌。 5.权利要求1所述酿酒酵母基因工程菌在微生物发酵制备7-DHC中的应用。 6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述酿酒酵母基因工程菌接种至发酵培养基，并添加初始培养基5～10％体积的正十二烷作为萃取剂，于28～32℃下进行发酵培养48～96h，发酵液经分离纯化获得所述7-DHC。