B族DNA聚合酶变体以及包含其的试剂套组
本发明所请是一种B族DNA聚合酶变体，其可提升核苷酸类似物的掺入效果，以利于多核苷酸的合成以及相关核酸模板的定序。更具体而言，利用该B族DNA聚合酶变体搭配一通常的核酸模板以及可逆染料终止子核苷酸下，得以有效进行DNA合成式定序法(sequencing‑by‑synthesis method)，以准确地测定该核酸模板的序列。
发明专利
CN202280066373.1
2022-06-28
CN118434848A
2024-08-01
C12N9/12(2006.01)
陈呈尧
陈呈尧;郑伊雯;洪于婷;陈玟婷
中国台湾新竹市东区光复路二段101号
北京维澳知识产权代理有限公司
曾晨
中国台湾;71
1.一种B族DNA聚合酶变体，包含： 一Exo I模体、一Exo II模体、一Exo III模体、一A模体、一B模体以及一C模体，分别对应于一共通序列(SEQ ID NO：1)的位置349至364、位置450至476、位置590至608、位置706至730、位置843至855及位置940至956； 至少一胺基酸取代，位于选自于由该Exo I模体、该Exo II模体以及该Exo III模体所组成群组中的一模体中的一位置；以及 至少一胺基酸取代，位于选自于由该A模体、该B模体以及该C模体所组成群组中的一模体中的一位置。 2.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是由一野生型B族DNA聚合酶修饰而成，该野生型B族DNA聚合酶包含选自于由SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17所组成群组的一胺基酸序列。 3.如权利要求2所述的B族DNA聚合酶变体，其中该野生型B族DNA聚合酶是一嗜高温菌(Thermococcus gorgonarius)DNA聚合酶(Tgo)、一嗜高温菌(Thermococcuskodakarensis)DNA聚合酶(Kod1)、一嗜高温菌属(菌株9°N-7)DNA聚合酶(9°N)、一激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)、一嗜高温菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)、一海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)DNA聚合酶(Mma)、一甲烷八迭球菌属(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶(Mac)、一人类DNA聚合酶δ催化p125次单元(hPOLD)、一酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DNA聚合酶δ催化次单元(ScePOLD)、一冰岛热棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶(Pis)、一硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶(Sso)、一绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)DNA聚合酶II(Pae)、一大肠杆菌(Escherichia. coli)DNA聚合酶II(Eco)、一噬菌体(肠杆菌噬菌体)RB69 DNA聚合酶(RB69)、一噬菌体(肠杆菌噬菌体)T4 DNA聚合酶(T4)或一噬菌体(芽孢杆菌噬菌体)Phi29 DNA聚合酶(Phi29)。 4.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的胺基酸是除D以外的任何胺基酸； 对应于SEQ ID NO：1位置355的胺基酸是除I以外的任何胺基酸； 对应于SEQ ID NO：1位置356的胺基酸是除E以外的任何胺基酸； 对应于SEQ ID NO：1位置715的胺基酸是除L以外的任何胺基酸； 对应于SEQ ID NO：1位置716的胺基酸是除Y以外的任何胺基酸；以及 对应于SEQ ID NO：1位置717的胺基酸是除P以外的任何胺基酸。 5.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的胺基酸是除D以外的任何胺基酸； 对应于SEQ ID NO：1位置355的胺基酸是除I以外的任何胺基酸； 对应于SEQ ID NO：1位置356的胺基酸是除E以外的任何胺基酸； 对应于SEQ ID NO：1位置715的胺基酸是除L以外的任何胺基酸； 对应于SEQ ID NO：1位置716的胺基酸是除Y以外的任何胺基酸； 对应于SEQ ID NO：1位置717的胺基酸是除P以外的任何胺基酸；以及 对应于SEQ ID NO：1位置854的胺基酸是除A以外的任意胺基酸。 6.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3的一嗜高温菌(Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶(Kod1)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：3的D141是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：3的E143是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：3的L408是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：3的Y409是由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：3的P410是由A、C、G、S或T所取代。 7.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4的一嗜高温菌属(菌株9°N-7)DNA聚合酶(9°N)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：4的D141是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：4的E143是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：4的L408是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：4的Y409是由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：4的P410是由A、C、G、S或T所取代。 8.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5的一激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：5的D141是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：5的E143是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：5的I409是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：5的Y410是由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：5的P411是由A、C、G、S或T所取代。 9.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6的一嗜高温菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：6的D141是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：6的E143是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：6的L411是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：6的Y412是由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：6的P413是由A、C、G、S或T所取代。 10.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8的一甲烷八迭球菌属(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶(Mac)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：8的D198是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：8的E200是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：8的L485是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：8的Y486是由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：8的P487是由A、C、G、S或T所取代。 11.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：11的一冰岛热棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶(Pis)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：11的D171是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：11的E173是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：11的M426是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：11的Y427是由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：11的P428是由A、C、G、S或T所取代。 12.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：12的一硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶(Sso)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：12的D231是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：12的E233是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：12的L518是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：12的Y519是由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：12的P520是由A、C、G、S或T所取代。 13.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3的一嗜高温菌(Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶(Kod1)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：3的D141是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：3的E143是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：3的L408是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：3的Y409是由A、C、D、F、G、H或I所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：3的P410是由A、C、G、S或T所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：3的A485是由C、D、E、F或L所取代。 14.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4的一嗜高温菌属(菌株9°N-7)DNA聚合酶(9°N)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：4的D141是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：4的E143是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：4的L408是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：4的Y409是由A、C、D、F、G、H或I所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：4的P410是由A、C、G、S或T所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：4的A485是由C、D、E、F或L所取代。 15.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5的一激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：5的D141是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：5的E143是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：5的L409是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：5的Y410是由A、C、D、F、G、H或I所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：5的P411是由A、C、G、S或T所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：5的A486是由C、D、E、F或L所取代。 16.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6的一嗜高温菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：6的D141是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：6的E143是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：6的L411是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：6的Y412是由A、C、D、F、G、H或I所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：6的P413是由A、C、G、S或T所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：6的A488是由C、D、E、F或L所取代。 17.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8的一甲烷八迭球菌属(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶(Mac)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：8的D198是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：8的E200是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：8的L485是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：8的Y486是由A、C、D、F、G、H或I所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：8的P487是由A、C、G、S或T所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：8的A565是由C、D、E、F或L所取代。 18.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：11的一冰岛热棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶(Pis)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：11的D171是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：11的E173是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：11的M426是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：11的Y427是由A、C、D、F、G、H或I所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：11的P428是由A、C、G、S或T所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：11的A508是由C、D、E、F或L所取代。 19.如权利要求1所述的B族DNA聚合酶变体，其中该B族DNA聚合酶变体是源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：12的一硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶(Sso)，且其中： 对应于SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：12的D231是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：12的E233是由A所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：12的L518是由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：12的Y519是由A、C、D、F、G、H或I所取代； 对应于SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：12的P520是由A、C、G、S或T所取代；以及 对应于SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：12的A601是由C、D、E、F或L所取代。 20.一种用于合成式定序反应的试剂套组，包括： 如权利要求1至19任一项所述的B族DNA聚合酶变体； 一引子；以及 复数核苷酸类似物，其是用以于适当条件下掺入该引子。