3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体、编码基因、载体及应用

摘要：

本发明涉及一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体及其编码基因，以及含有该编码基因的重组载体和基因工程菌，以及所述3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体在微生物催化甾体C1,2脱氢制备甾体类药物中的应用。所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶经定点饱和突变获得，所述突变的位点为下列之一或其中两种以上的组合：第161位、第170位、第545位、第161位、第545位。本发明通过多序列比对选点并进行定点定向突变改变蛋白质氨基酸残基，将酶活性催化中心氨基酸突变，提高3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶催化效率；将催化活性有显著提高的突变基因进行扩增，利用穿梭质粒将KsdD基因过表达于简单节杆菌中，进行转化，构建的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶的重组大肠杆菌可将3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶酶活较出发菌株提高1.1～1.6倍更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN202211738640.3

申请日期：2022-12-31

公开/公告号：CN116410941A

公开/公告日：2023-07-11

主分类号：C12N9/02(2006.01)

申请/专利权人:浙江工业大学

发明/设计人:张博;李梦娟;朱四方;柳志强;郑裕国

主申请人地址:310000 浙江省杭州市拱墅区潮王路18号

专利代理机构:浙江千克知识产权代理有限公司

代理人:冷红梅

国别省市代码:浙江;33

权利要求：

1.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的3-甾酮-Δ1-脱氢酶经定点饱和突变获得，所述突变的位点为下列之一或其中两种以上的组合：第161位、第170位、第545位、第161位、第545位。 2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于所述突变为下列之一或其中两种以上的组合：第161位丝氨酸突变为甘氨酸、第170位色氨酸突变为缬氨酸、第545位苏氨酸突变为脯氨酸、第161位丝氨酸突变为甘氨酸、第545位苏氨酸突变为脯氨酸。 3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQ IDNO.2～5之一所示。 4.编码权利要求1～3之一所述突变体的基因。 5.含有权利要求4所述编码基因的重组载体。 6.含有权利要求4所述编码基因的重组基因工程菌。 7.权利要求1所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体在微生物催化甾体C1,2脱氢制备甾体类药物中的应用。 8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述甾体类药物为雄甾-1,4-二烯-1,17-二酮，反应底物为雄烯二酮。