7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在7-氧代-石胆酸合成中的应用
本发明公开了7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其在7‑氧代‑石胆酸合成中的应用，属于基因工程和生物催化技术领域。本发明通过将Brucella melitensis 7α‑羟基类固醇脱氢酶(Bm7α‑HSDH)口袋特定的氨基酸实施定点突变，并组合了部分优势突变，获得了热稳定性和催化效率均得到显著提升的突变体。在催化底物鹅去氧胆酸合成7‑氧代‑石胆酸的反应中，突变体酶活力最多提高约45倍，催化效率提高约122倍，Tm值最大可提升约12℃，为生物法催化合成熊去氧胆酸提供了优质的生物酶和前体化合物，为实现其工业化生产奠定了坚实的研究基础。
发明专利
CN202211637423.5
2022-12-16
CN116200352A
2023-06-02
C12N9/04(2006.01)
江南大学
张荣珍;柳志永
214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号
哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
赵巧娜
江苏;32
1.一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的； 或，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的第301位谷氨酰胺突变为异亮氨酸得到的； 或，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，同时将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的。 2.编码权利要求1所述突变体的基因。 3.携带权利要求2所述基因的重组载体。 4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pET-21a、pET-21a或pRSFDuet-1为表达载体。 5.表达权利要求1所述的突变体、或携带权利要求2所述的基因、或携带权利要求3或4所述的重组载体的重组细胞。 6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。 7.一种用于催化鹅去氧胆酸合成7-氧代-石胆酸的催化剂，其特征在于，所述催化剂为权利要求1所述的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，或采用权利要求5或6所述重组细胞制备得到的含有7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的酶液或其冻干粉。 8.一种合成7-氧代-石胆酸的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的突变体，或采用权利要求5或6所述重组细胞制备得到的突变体添加至含有底物鹅去氧胆酸、辅酶NAD+的反应体系中，催化制备得到7-氧代-石胆酸。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还含有pH 8.0～9.5的缓冲盐溶液；所述底物鹅去氧胆酸的浓度为2～50mM，反应温度为20～40℃。 10.权利要求1所述的突变体、或权利要求2所述的基因、或权利要求3或4所述的重组载体、或权利要求5或6所述的重组细胞在制备7-氧代-石胆酸或含有7-氧代-石胆酸的产品中的应用。