7β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在合成熊去氧胆酸中的应用
本发明涉及7β‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其在合成熊去氧胆酸中的应用。具体公开了来源于玫瑰球菌属(Roseococcus sp.)的7β‑羟基类固醇脱氢酶，其编码基因和氨基酸序列，含有该基因的重组载体和重组表达转化体，以及利用该7β‑羟基类固醇脱氢酶与异丙醇脱氢酶组合固定化制备熊去氧胆酸的应用。制备的固定化酶连续使用1个月，未观察到活力下降。与现有技术相比，本发明具有催化剂稳定性好、辅酶应用成本低、操作简单、反应条件温和、环境友好、产率高等优势，在酶法催化鹅去氧胆酸转化合成熊去氧胆酸中有着良好的应用前景。
发明专利
CN202211460664.7
2022-11-17
CN116103254A
2023-05-12
C12N9/04(2006.01)
华东理工大学
许建和;李春秀;李海鹏;杨秉义;潘江
200237 上海市徐汇区梅陇路130号
上海科盛知识产权代理有限公司
褚明伟
上海;31
1.一种高稳定性的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，其选自由以下氨基酸序列组成的蛋白质中的一种： (1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第28位甘氨酸替换为丙氨酸； (2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸； (3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第114位苏氨酸替换为甘氨酸； (4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第116位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸； (5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位苏氨酸替换为缬氨酸； (6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第132位丙氨酸替换为谷氨酰胺； (7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第135位缬氨酸替换为亮氨酸； (8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸，第124位苏氨酸替换为缬氨酸； (9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸，第135位缬氨酸替换为亮氨酸； (10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第116位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸，第124位苏氨酸替换为缬氨酸； (11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第124位苏氨酸替换为缬氨酸，第135位缬氨酸替换为亮氨酸； (12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第94位苏氨酸替换为异亮氨酸，第116位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸。 2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述7β-羟基类固醇脱氢酶突变体。 3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。 4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体。 5.一种羟基类固醇脱氢酶催化剂，其特征在于，所述的羟基类固醇脱氢酶催化剂是以下的任意一种： (1)培养如权利要求4所述的重组表达转化体或表达如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的7β-羟基类固醇脱氢酶的重组表达转化体，分离获得的静息细胞； (2)如(1)所述的静息细胞冷冻干燥得到的冻干细胞； (3)如(1)所述的静息细胞破碎获得的7β-羟基类固醇脱氢酶的粗酶液； (4)如(3)所述7β-羟基类固醇脱氢酶的粗酶液冷冻干燥得到的粗酶粉。 6.一种7β-羟基类固醇脱氢酶在合成熊去氧胆酸中的应用，其特征在于，使用如权利要求5所述羟基类固醇脱氢酶催化剂催化7羰基石胆酸不对称还原，然后从反应混合物中分离提取产物熊去氧胆酸。 7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的不对称还原的反应需要辅酶NADH，反应中的NADH氧化为NAD+，通过偶联其他脱氢酶，催化NAD+还原再生为NADH； 所述的其他脱氢酶为葡萄糖脱氢酶或醇脱氢酶。 8.一种7β-羟基类固醇脱氢酶/醇脱氢酶共固定化酶催化剂，其特征在于：将如权利要求1所述的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体或如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的7β-羟基类固醇脱氢酶和醇脱氢酶共固定化到环氧树脂颗粒上。 9.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，使用连续流填充床反应器催化酶法合成熊去氧胆酸，所述连续流填充床反应器包含如下组成部分： (1)将如权利要求8所述的共固定化酶催化剂填充到空不锈钢柱子中构建的酶填充柱； (2)反应原料储罐、物料输送泵、物料输送管路、温度控制系统和产物储罐； 所述反应原料储罐出口与物料输送泵入口连通，物料输送泵出口与酶填充柱入口连通，酶填充柱的出口与产物储罐连通；所述酶填充柱置于温控系统中，反应原料储罐中的7-羰基石胆酸底物溶液通过物料输送泵输送进入酶填充柱中，在酶填充柱中底物7-羰基石胆酸被还原生成熊去氧胆酸并流出酶填充柱，流出的溶液通过物料输送管路进入到产物储罐里。 10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：还包括辅因子循环再利用的步骤，包括以下步骤： (1)用盐酸将产物储罐中的反应液酸化至pH 2～5； (2)将所述的酸化后的反应液过滤，分离产物熊去氧胆酸； (3)用氢氧化钠调节滤液pH为7.5～8.5； (4)在以上溶液中加入7-羰基石胆酸得到7-羰基石胆酸反应原料底物溶液，加入到反应原料储罐中进行新的反应。