ALS疾病模型犬的建立方法
本发明涉及通过转基因技术制备肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)疾病模型犬的方法，具体提供了利用转基因技术制备hSOD1‑G93A转基因模型犬的方法，以及获得的模型犬的细胞、组织和器官。
发明专利
CN202211412955.9
2022-11-11
CN116004717A
2023-04-25
C12N15/85(2006.01)
北京希诺因生物科技有限公司%神济昌华(北京)生物科技有限公司
米继东;赵建平;贾怡昌;郭炜;齐辉辉;彭林
102604 北京市大兴区礼贤镇元平北路1号自贸试验区大兴机场片区自贸创新服务中心E7-E8栋;
北京睿阳联合知识产权代理有限公司
张颖
1.肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)疾病模型犬的建立方法，所述方法包括利用转基因技术获得hSOD1-G93A转基因的犬受精卵或犬体细胞。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1)根据hSOD1基因的CDS区设计扩增引物，并进行PCR扩增获得hSOD1基因的CDS片段； (2)对步骤(1)得到的hSOD1基因的CDS片段进行酶切，获得酶切产物，将获得的酶切产物与线性化的骨架载体连接构建hSOD1重组质粒； (3)根据hSOD1重组质粒设计hSOD1-G93A突变的扩增引物，通过扩增制备hSOD1-G93A重组质粒； (4)将hSOD1-G93A重组质粒和转座酶表达质粒共同导入犬受精卵或犬体细胞中，获得hSOD1-G93A犬受精卵或犬体细胞。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述扩增引物包括： 正向引物：CGGCTAGCatggcgacgaaggccgtgt(SEQ ID NO：2)； 反向引物：TTGCGGCCGCttattgggcgatcccaattacac(SEQ ID NO：3)。 4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述骨架载体选自PiggyBacDual promoter(PB513B-1)载体。 5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述hSOD1-G93A突变的扩增引物包括： 正向引物：GACTGCTGACAAAGATGCTGTGGCCGATGTGTCTATT(SEQ ID NO：4)； 反向引物：AATAGACACATCGGCCACAGCATCTTTGTCAGCAGTC(SEQ ID NO：5)。 6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述扩增通过环形聚合酶延伸法方式进行。 7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述转座酶表达质粒选自Super PiggyBac Transposase转座酶表达质粒。 8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将获得的hSOD1-G93A犬受精卵移植到受体母犬的输卵管内，从而制备ALS疾病模型犬。 9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将获得的hSOD1-G93A犬体细胞的细胞核移植到犬去核卵母细胞中，然后将核移植后的犬去核卵母细胞移植到受体母犬的输卵管内，从而制备ALS疾病模型犬。 10.由权利要求1至9任一项的方法获得的ALS疾病模型犬的体细胞、组织和器官。 11.根据权利要求10所述的体细胞、组织和器官，其特征在于，所述体细胞、组织和器官包含SEQ ID NO：6所示的序列。 12.一种引物对组合物，所述引物对的序列如下： 正向引物：ATGTCGTAACAACTCCGCCCCA(SEQ ID NO：7)； 反向引物：TGGGGTAGGTGCCGAAGTGGTAGA(SEQ ID NO：8)。 13.一种试剂盒，所述试剂盒包含引物对，所述引物对的序列如下： 正向引物：ATGTCGTAACAACTCCGCCCCA(SEQ ID NO：7)； 反向引物：TGGGGTAGGTGCCGAAGTGGTAGA(SEQ ID NO：8)。 14.根据权利要求12所述的引物对或根据权利要求13所述的试剂盒在检测包含SEQIDNO：6所示的序列片段的基因组序列的ALS疾病模型犬中的应用。