BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质及其制备方法
本发明公开了一种BCR‑ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质及其制备方法，该方法提取获得了含有BCR‑ABL1P210型融合基因b2a2和b3a2两种突变形式的基因组RNA，配置RNA储存缓冲液及定量标准品溶液，并设计了相应的引物及探针，采用一步法逆转录数字PCR方法，以BCR‑ABL1P210型融合突变基因组RNA为模板进行PCR扩增，采集荧光信号来检测BCR‑ABL1P210型融合基因b2a2和b3a2的表达，从而获得BCR‑ABL1P210型融合基因b2a2、b3a2和ABL‑WT拷贝数含量和突变基因丰度作为其量值。
发明专利
CN202211387155.6
2022-11-07
CN116334180A
2023-06-27
C12Q1/6806(2018.01)
中国计量科学研究院%深圳中国计量科学研究院技术创新研究院
董莲华;杨怡;王霞
100029 北京市朝阳区北三环东路18号;
北京东方尚禾专利代理事务所(特殊普通合伙)
李厚铭
1.一种BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)提取含有BCR-ABL1 P210型突变的细胞系基因组RNA，检测其浓度及纯度； (2)以所述BCR-ABL1 P210型突变的细胞系基因组RNA为模板采用逆转录试剂盒及PCR扩增得到有目标融合突变的基因片段，通过Sanger测序PCR产物来验证目标基因序列的正确性； (3)添加一定酵母RNA溶液于RNA solution中制备成RNA储存缓冲液； (4)将所述细胞系基因组RNA添加至所述RNA储存缓冲液中稀释成一定浓度的标准品溶液； (5)设计并获得BCR-ABL1 P210型融合基因b2a2特异性引物1和引物2及特异性探针1，所述引物1、引物2的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示； 设计并获得BCR-ABL1 P210型融合基因b3a2特异性引物3和引物4及特异性探针2；所述引物3和引物4的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示； 设计并获得ABL-WT基因特异性引物5和引物6及特异性探针3；所述引物5和引物6的核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，所述探针3的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示； (6)采用一步法逆转录数字PCR方法，以所述的BCR-ABL1 P210型融合突变基因组RNA为模板进行PCR扩增，采集荧光信号来检测BCR-ABL1 P210型融合基因b2a2和b3a2的表达，从而获得BCR-ABL1 P210型融合基因b2a2、b3a2和ABL-WT拷贝数含量和突变基因丰度作为其量值。 2.根据权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)和步骤(4)中，在配置一定浓度的RNA储存缓冲溶液以及标准品溶液时，采用天平称量法进行称量稀释混合。 3.根据权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，酵母RNA浓度为5-500ng/μL。 4.根据权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，探针1、探针2和探针3的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1荧光基团。 5.根据权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，引物1和引物2的反应浓度为500nM，所述探针1的反应浓度为400nM；所述引物3和引物4的反应浓度为400nM，所述探针2的反应浓度为300nM；所述引物5和引物6的反应浓度为500nM，所述探针3的反应浓度为400nM。 6.根据权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，其特征在于：所述一步法逆转录数字PCR方法，其反应体系包括基因组：0～100ng，2×One-stepSuperMix(Bio-Rad) 5μL，reverse transcriptase 2μL，300mM DTT 1μL，引物1和引物2：1.0μL，探针1：0.8μL；或者引物3和引物4：0.8μL，探针2：0.6μL；或者引物5和引物6：1.0μL，探针3：0.8μL。 7.根据权利要求6所述的BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，其特征在于：PCR反应条件为：45℃逆转录60min，95℃变性10min；随后94℃变性30sec，58℃/60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。 8.根据权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质的制备方法，其特征在于：所述的突变基因丰度计算公式为 9.权利要求1-8任一所述制备方法制得的BCR-ABL1融合基因定量基因组RNA标准物质。