B16-CD33 CAR-NK细胞及其治疗肿瘤的用途
本发明涉及B16‑CD33CAR‑NK细胞及其治疗肿瘤的用途。一方面，涉及一表达了嵌合抗原受体序列的CAR‑NK细胞，所述嵌合抗原受体包括作为第一信号的抗原结合域、跨膜结构域、作为第二信号的细胞内传导结构域、以及表达CD16抗体的第三信号域，该CAR‑NK细胞的制备方法包括步骤：质粒合成、病毒包装、病毒收获及浓缩、NK细胞的制备、慢病毒感染。还涉及所述CAR‑NK细胞在制备用于治疗肿瘤的药剂中的用途。本发明制得的CAR‑NK细胞能够分泌CD16抗体，并且包含靶向CD33的嵌合抗原受体。本发明的各个方面呈现如说明书所述优良效果。
发明专利
CN202211206307.8
2022-09-30
CN117230013A
2023-12-15
C12N5/10(2006.01)
深圳博雅感知药业有限公司
张蕊;肖海蓉;裴丽环;刘庆喜;魏卿
518122 广东省深圳市坪山区坑梓街道金沙社区金辉路14号深圳市生物医药创新产业园区10号楼1501
广东;44
1.一种表达了嵌合抗原受体序列的CAR-NK细胞，所述嵌合抗原受体包括：a)包含SEQID NO.1所示的氨基酸序列的作为第一信号的抗原结合域、b)跨膜结构域、c)作为第二信号的细胞内传导结构域、以及d)包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的表达CD16抗体的第三信号域；所述CAR-NK细胞是由包括以下步骤的方法制备得到的： (1)质粒合成： 使用载体pLVX合成B16-CD33 CAR-NK质粒，该质粒由CD33单链可变区、铰链区、跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号、B16抗体构成； (2)病毒包装： 将步骤1构建的B16-CD33 CAR-NK质粒，以及病毒包装质粒BaEV-gp和病毒包装质粒SPAX2三者按5：1.5：3.5的比例与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至293T细胞，至融合度达70％～85％，转染后6h更换DMEM完全培养基； (3)病毒收获及浓缩： 分别在48小时和72小时，收集细胞培养上清液，在4℃下4000rpm离心15min后取上清，0.45μm滤膜过滤，以22000rpm超速离心2小时后弃上清，用新鲜的DMEM培养基重悬沉淀，得到病毒浓缩液，备用； (4)NK细胞的制备： 取20ml的Ficoll淋巴细胞分离液于离心管中，将采集的外周血20ml于Ficoll液面上方1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上层；在4℃下500g离心15min，离心后从管底至液面依次分为4层：红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层即白膜层、血浆层；用移液管直接吸去上层的血浆，轻轻吸出单个核细胞层，放入新的离心管中，用PBS悬浮至40ml，在4℃下500g离心5min，重复两次以清洗细胞；用PBS重悬细胞沉淀并计数，将细胞密度调整至1*107个细胞/ml；取5*107个细胞加入100μL的CD3 Microbeeds重悬，4-8℃孵育15min；将LS磁珠分选柱置于磁力架上，使用2ml PBS冲洗LS柱后，将孵育后的细胞悬液加入到LS柱里，使之流到50ml离心管，作为要收集的细胞；用PBS洗两遍，计数后取2*107单个核细胞备用；复苏NK细胞扩增试剂中的滋养层细胞，然后放入盛有10ml完全培养基即NK细胞无血清培养基的T-75培养瓶中，再将刚制备好的单个核细胞加入T-75培养瓶中混合培养，培养3天，为NK细胞；所述NK细胞无血清培养基增补有5％自体血浆+200IU/ml IL-2+80U/ml庆大霉素； (5)慢病毒感染： 将NK细胞取出，悬浮细胞计数，接种于六孔板中，每孔种3*106个NK细胞，并加入1ml的ALyS505NK-EX培养基，按MOI＝20的感染系数加入制备好的病毒，感染8-10天，收获细胞，即得B16-CD33 CAR-NK细胞。 2.根据权利要求1的CAR-NK细胞，其中所述B16-CD33 CAR的质粒构建原件及图谱如图2所示。 3.根据权利要求1的CAR-NK细胞，其中步骤2中，质粒与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至T-75培养瓶中的293T细胞。 4.根据权利要求1的CAR-NK细胞，步骤2中，质粒与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至T-75培养瓶中的293T细胞，至融合度达70％～85％。 5.根据权利要求1的CAR-NK细胞，其还进一步包括对经慢病毒感染的B16-CD33 CAR-NK细胞进行慢病毒转染效率检测。 6.根据权利要求1的CAR-NK细胞，其还进一步包括对经慢病毒感染的B16-CD33 CAR-NK细胞进行慢病毒转染效率检测，平均转染效率大于30％。 7.根据权利要求1的CAR-NK细胞，其还进一步包括对所得B16-CD33 CAR-NK细胞进行NK细胞脱颗粒流式检测。 8.根据权利要求1的CAR-NK细胞，其能够分泌CD16抗体；和/或，其包含靶向CD33的嵌合抗原受体。 9.权利要求1～9任一项所述CAR-NK细胞在制备用于治疗肿瘤的药剂中的用途。 10.制备权利要求1～9任一项所述CAR-NK细胞的方法，其包括如下步骤： (1)质粒合成： 使用载体pLVX合成B16-CD33 CAR-NK质粒，该质粒由CD33单链可变区、铰链区、跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号、B16抗体构成； (2)病毒包装： 将步骤1构建的B16-CD33 CAR-NK质粒，以及病毒包装质粒BaEV-gp和病毒包装质粒SPAX2三者按5：1.5：3.5的比例与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至293T细胞，至融合度达70％～85％，转染后6h更换DMEM完全培养基； (3)病毒收获及浓缩： 分别在48小时和72小时，收集细胞培养上清液，在4℃下4000rpm离心15min后取上清，0.45μm滤膜过滤，以22000rpm超速离心2小时后弃上清，用新鲜的DMEM培养基重悬沉淀，得到病毒浓缩液，备用； (4)NK细胞的制备： 取20ml的Ficoll淋巴细胞分离液于离心管中，将采集的外周血20ml于Ficoll液面上方1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上层；在4℃下500g离心15min，离心后从管底至液面依次分为4层：红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层即白膜层、血浆层；用移液管直接吸去上层的血浆，轻轻吸出单个核细胞层，放入新的离心管中，用PBS悬浮至40ml，在4℃下500g离心5min，重复两次以清洗细胞；用PBS重悬细胞沉淀并计数，将细胞密度调整至1*107个细胞/ml；取5*107个细胞加入100μL的CD3 Microbeeds重悬，4-8℃孵育15min；将LS磁珠分选柱置于磁力架上，使用2ml PBS冲洗LS柱后，将孵育后的细胞悬液加入到LS柱里，使之流到50ml离心管，作为要收集的细胞；用PBS洗两遍，计数后取2*107单个核细胞备用；复苏NK细胞扩增试剂中的滋养层细胞，然后放入盛有10ml完全培养基即NK细胞无血清培养基的T-75培养瓶中，再将刚制备好的单个核细胞加入T-75培养瓶中混合培养，培养3天，为NK细胞；所述NK细胞无血清培养基增补有5％自体血浆+200IU/ml IL-2+80U/ml庆大霉素； (5)慢病毒感染： 将NK细胞取出，悬浮细胞计数，接种于六孔板中，每孔种3*106个NK细胞，并加入1ml的ALyS505NK-EX培养基，按MOI＝20的感染系数加入制备好的病毒，感染8-10天，收获细胞，即得B16-CD33 CAR-NK细胞。