AP质粒及其应用、PAP I酶的PACE定向进化系统及PAP I酶突变体

摘要：

本发明提供一种AP质粒，其特征为：所述质粒表达gIII‑neg蛋白，且在其核糖体结合位点后部插入了一个或多个SEQ ID No.1所示的RyhB结合序列。还公开了其在PAP I酶的PACE定向进化中的应用及PAP I酶的PACE定向进化系统。并公开了筛选得到的PAP I酶突变体、编码基因、原核表达载体及原核表达系统。本发明在PACE定向进化方法中引入了大肠杆菌非编码RNA RyhB sRNA，抑制gIII‑neg蛋白的翻译，解除gIII‑neg蛋白对子代噬菌体包装的不利影响。聚腺苷化活性越强的PAP I，越能延长RyhB的半衰期，促进后者对gIII‑neg蛋白的翻译抑制作用。噬菌体在多次传代后形成种群优势并被分离测序，最终获得活力显著提升的PAP I。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN202211087055.1

申请日期：2022-09-07

公开/公告号：CN116240228A

公开/公告日：2023-06-09

主分类号：C12N15/70(2006.01)

申请/专利权人:翌圣生物科技(上海)股份有限公司

发明/设计人:宋东亮;唐琼卫;刘想;胡慧芳

主申请人地址:200120 上海市浦东新区天雄路166弄1号楼402室

专利代理机构:苏州根号专利代理事务所(普通合伙)

代理人:朱华庆

国别省市代码:上海;31

权利要求：

1.一种AP质粒，其特征为：所述质粒表达gIII-neg蛋白，且在其核糖体结合位点后部插入了一个或多个SEQ ID No.1所示的RyhB结合序列。 2.权利要求1所述的AP质粒在PAP I酶的PACE定向进化中的应用。 3.一种PAP I酶的PACE定向进化系统，其特征在于包括：权利要求1所述的AP质粒、DP质粒和SP质粒、宿主菌，所述DP质粒携带野生型gIII基因和野生型PAP I表达基因，所述SP质粒为M13噬菌体基因组，其中gIII基因被野生型PAP I表达基因取代。 4.根据权利要求2所述的PAP I酶的PACE定向进化系统，其特征在于：所述AP质粒和DP质粒含有不同的抗性基因。 5.根据权利要求2所述的PAP I酶的PACE定向进化系统，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。 6.一种PAP I酶突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。 7.权利要求6所述的PAP I酶突变体的编码基因，其特征在于其核酸序列如SEQ IDNo.4所示。 8.权利要求6所述的PAP I酶突变体的原核表达载体。 9.根据权利要求8所述的PAP I酶突变体的原核表达载体，其特征在于：载体采用pET21b(+)质粒。 10.权利要求6所述的PAP I酶突变体的原核表达系统，其特征在于：将权利要求8或9所述的原核表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。