Argonaute介导的一锅法microRNA检测体系及检测方法
本发明公开了一种Argonaute介导的一锅法microRNA检测体系及检测方法。本发明提供了一种microRNA检测方法，其包括将待测核酸样本、指数扩增反应体系和microRNA检测体系混合，形成混合反应体系，进行反应，获得反应物中的荧光信号，实现microRNA的检测；microRNA检测体系包括向导DNA、Argonaute核酸酶和检测探针，且指数扩增反应体系扩增目标物microRNA所获得的扩增产物作为向导DNA。本发明的体系及方法首次建立了EXPAR扩增与Ago特异性剪切一体化的一锅法检测，实现在单个反应体系中同时扩增、剪切和单个或多个目标物检测，避免气溶胶污染，操作便捷、方法高效。
发明专利
CN202210917595.1
2022-08-01
CN115992206A
2023-04-21
C12Q1/6848(2018.01)
复旦大学
林秋媛;陈惠;孔继烈
200082 上海市杨浦区邯郸路220号
北京林达刘知识产权代理事务所(普通合伙)
刘新宇%李茂家
上海;31
1.一种microRNA检测方法，其包括：将待测核酸样本、指数扩增反应体系和microRNA检测体系混合，形成混合反应体系，进行反应，获得反应物中的荧光信号，实现microRNA的检测；其中， 所述microRNA检测体系包括向导DNA、Argonaute核酸酶和检测探针，且所述指数扩增反应体系扩增目标物microRNA所获得的扩增产物作为所述向导DNA。 2.根据权利要求1所述的microRNA检测方法，其中，所述Argonaute核酸酶选自来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的CpAgo核酸酶、来自巴特勒肠杆菌(Intestinibacter bartlettii)的IbAgo核酸酶、来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacteriumgregoryi)的NgAgo核酸酶中的一种或多种； 优选地，所述Argonaute核酸酶为来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的CpAgo核酸酶。 3.根据权利要求1或2所述的microRNA检测方法，其中，在所述混合反应体系中，所述Argonaute核酸酶的含量为0.01-200nM。 4.根据权利要求1～3中任一项所述的microRNA检测方法，其中，所述的指数扩增反应体系包括扩增模板、DNA聚合酶、切口酶、dNTP、RNase抑制剂和酶缓冲液。 5.根据权利要求4所述的microRNA检测方法，其中，所述的DNA聚合酶为Vent(exo-)DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶；和/或， 所述的切口酶为限制性核酸内切酶或切口核酸内切酶； 优选的，所述的切口酶为限制性核酸内切酶； 更优选的，所述限制性核酸内切酶为Nt.BstNBI。 6.根据权利要求4或5所述的所述的microRNA检测方法，其中，所述的酶缓冲液包括反应缓冲液和NEBufferTMr3.1中的一种或多种。 7.根据权利要求1～6中任一项所述的microRNA检测方法，其中，所述的检测探针带有荧光基团和淬灭基团，且所述的检测探针包括与采用指数扩增反应体系扩增目标物microRNA所获得的扩增产物互补的区域； 优选地，在所述的检测探针中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述的检测探针的5’端和3’端。 8.根据权利要求1～7中任一项所述的microRNA检测方法，其中，所述的待测核酸样本包括来自生物样本的核酸； 任选地，所述的生物样本选自：血液、细胞、血清、唾液、体液、血浆、尿液、前列腺液、支气管灌洗液、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、腹腔液、粪便或其组合。 9.根据权利要求1～8中任一项所述的microRNA检测方法，其中，形成混合反应体系，进行反应的反应条件为：在50-60℃条件下，反应10-30min，之后在30-50℃条件下反应10-30min。 10.根据权利要求1～9中任一项所述的microRNA检测方法，其中，在进行所述的microRNA检测方法之前还包括生物样本的预处理的步骤，其包括提取生物样本中的总microRNA。 11.一锅法microRNA检测体系，其包含待测核酸样本、指数扩增反应体系和microRNA检测体系； 其中，所述microRNA检测体系包括向导DNA、Argonaute核酸酶和检测探针，且所述指数扩增反应体系扩增目标物microRNA所获得的扩增产物作为所述向导DNA； 所述Argonaute核酸酶选自来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的CpAgo核酸酶、来自巴特勒肠杆菌(Intestinibacter bartlettii)的IbAgo核酸酶、来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的NgAgo核酸酶中的一种或多种； 任选地，所述的指数扩增反应体系包括扩增模板、DNA聚合酶、切口酶、dNTP、RNase抑制剂和酶缓冲液。