10-去乙酰巴卡亭Ⅲ10β-O-乙酰转移酶突变体及其应用
本发明属于生物工程领域，涉及10‑去乙酰巴卡亭III 10β‑O‑乙酰转移酶突变体及其应用，提供了10‑去乙酰巴卡亭III 10β‑O‑乙酰转移酶(DBAT)一系列突变体蛋白，这些蛋白均能专一性地将乙酰辅酶A等的酰基转移到10‑去乙酰紫杉烷的C10位羟基上，生成紫杉醇或其类似物。本发明涉及DBAT突变体的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列，以及DBAT突变体蛋白在利用10‑去乙酰紫杉醇等10‑去乙酰紫杉烷底物合成紫杉醇或其类似物上的应用；特别是以10‑去乙酰紫杉醇为底物，以乙酰辅酶A为酰基供体直接合成紫杉醇。
发明专利
CN202210444105.0
2022-04-26
CN116987681A
2023-11-03
C12N9/10(2006.01)
中国医学科学院药物研究所
朱平;陈天娇
100050 北京市西城区南纬路甲2号张徐斌
北京;11
1.一种10-去乙酰巴卡亭Ⅲ10β-O-乙酰转移酶DBAT的突变体蛋白，其中，与SEQ ID NO1所示的野生型蛋白DBAT相比，所述的突变体蛋白的氨基酸序列至少具有R345C氨基酸突变。 2.如权利要求1所述的突变体蛋白，其中，所述突变体蛋白进一步具有选自如下的一种或多种氨基酸突变：G38R、V39A、V58A、L123H、V158M、G163S、Q213R、C216H、C216R、P217K、S219T、G222E、S294L、F301V、E350M、S351D、L383I、S396G、S415L、M417L、S420L、I421V、V422M。 3.如权利要求1或2所述的突变体蛋白，其中，所述突变体蛋白的氨基酸序列为选自SEQID NO 2～SEQ ID NO 28所示的氨基酸序列，以及与SEQ ID NO 2～SEQ ID NO 28中所示任一条氨基酸序列的同源性≥85％，优选其同源性≥95％，并具有酰基转移酶活性的衍生多肽。 4.如权利要求1-3中任一项所述的突变体蛋白，其中，所述的突变体蛋白进一步具有选自如下的一种或多种修饰：乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰。 5.如权利要求1-4中任一项所述的突变体蛋白，其中，所述的突变体蛋白进一步连接有选自如下的一种或多种标签：6×His、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、ProfinityeXact。 6.一种编码权利要求1-5中任一项所述的突变体蛋白的多核苷酸。 7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自SEQ ID NO 30～SEQ IDNO 56所示的序列，以及与SEQ ID NO 30～SEQ ID NO 56中任一条所示序列的同源性≥95％，优选其同源性≥98％的核苷酸序列。 8.一种含有权利要求6或7所述的多核苷酸的重组质粒。 9.一种整合有权利要求6或7任一项所述的多核苷酸或权利要求8所述的重组质粒的重组细胞。 10.如权利要求9所述的重组细胞，其中，所述重组细胞采用如下宿主细胞构建得到：大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、构巢曲霉、枯草芽孢杆菌或农杆菌。 11.权利要求1～5任一项所述的突变体蛋白或权利要求6或7所述的核苷酸序列或权利要求8所述的重组质粒或权利要求9所述的重组细胞在催化10-去乙酰紫杉烷酰基化为10-酰基紫杉烷中的应用。 12.根据权利要求11所述的应用，所述的10-去乙酰紫杉烷包括10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ。 13.根据权利要求11或12所述的应用，所述的酰基供体包括乙酰辅酶A、丙酰辅酶A和丁酰辅酶A。