ATTB细胞系、源自其的转基因细胞系及其制备方法
一种基因修饰的哺乳动物细胞和基因修饰的哺乳动物细胞系，包含插入哺乳动物细胞基因组的染色体上的靶基因座中的重组序列，其中该重组序列包含来自耻垢分枝杆菌的Bxb1attB序列。一种转基因哺乳动物细胞和转基因哺乳动物细胞系，包含稳定整合于哺乳动物基因组的染色体上的靶基因座中的异源核酸，其中该异源核酸包含配置为由转基因哺乳动物细胞表达的异源基因。
发明专利
CN202180078833.8
2021-09-24
CN116615533A
2023-08-18
C12N5/16(2006.01)
阿尔伯爱因斯坦医学院
威廉·R·雅各布斯;劳伦斯·莱昂;赖吉·卢科塞;安娜·葆拉·德·奥利韦拉
美国纽约
北京康信知识产权代理有限责任公司
杜升
美国;US
1.一种基因修饰的哺乳动物细胞，包含插入Vero细胞基因组的染色体上的靶基因座的重组序列，其中所述重组序列包含来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的Bxb1attB序列。 2.根据权利要求1所述的基因修饰的哺乳动物细胞，其中，所述哺乳动物细胞是Vero细胞，并且所述靶基因座包括Vero细胞基因组的6号染色体上的腺相关病毒整合位点1(AAVS1)。 3.根据权利要求2所述的基因修饰的哺乳动物细胞，其中，attB位点插入于AAVS1基因座的1529和1530位之间、AAVS1基因座的2155和2156位之间、AACS1基因座的2408和2409位之间或其组合。 4.根据权利要求2所述的基因修饰的哺乳动物细胞，其中，包含所述重组序列的AAVS1基因座具有SEQ ID NO 22的4千碱基序列。 5.根据权利要求1所述的基因修饰的哺乳动物细胞，其中，所述attB序列具有GGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCGTCGTCAGGATCAT(SEQ ID NO 2)的序列。 6.一种细胞系，包含根据权利要求1所述的基因修饰的哺乳动物细胞。 7.一种生产基因修饰的哺乳动物细胞的方法，所述基因修饰的哺乳动物细胞包含插入于Vero细胞基因组的染色体上的靶基因座中的重组序列，其中所述重组序列包含来自耻垢分枝杆菌的Bxb1 attB序列，所述方法包括： 提供复合体，所述复合体包含 引导RNA，包含与所述靶基因座上的靶位点杂交的寡核苷酸序列，和 Cas9核酸内切酶； 提供包含所述attB序列的单链DNA序列；和 将所述复合体和所述单链DNA序列引入Vero细胞中以获得包含插入于所述靶基因座中的Bxb1 attB序列的基因修饰的Vero细胞。 8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述靶基因座包含哺乳动物细胞基因组的第6号染色体上的腺相关病毒整合位点1(AAVS1)。 9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述Bxb1 attB序列插入于AAVS1基因座的1529和1530位之间、AAVS1基因座的2155和2156位之间、AAVS1基因座的2408和2409位之间或其组合。 10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述Cas9核酸内切酶在所述靶位点与gRNA杂交时催化所述靶位点处的DNA断裂。 11.根据权利要求7所述的方法，其中，所述单链DNA序列具有SEQ ID NO 1的序列。 12.根据权利要求7所述的方法，其中，所述引导RNA具有SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO21的序列，或其组合。 13.一种转基因哺乳动物细胞，包含稳定整合于所述哺乳动物细胞的基因组的染色体上的靶基因座中的异源核酸，其中所述异源核酸包含配置为由所述转基因哺乳动物细胞表达的异源基因。 14.根据权利要求13所述的转基因哺乳动物细胞，其中，所述哺乳动物细胞是Vero细胞，并且所述靶基因座包含所述哺乳动物细胞的基因组的第6号染色体上的腺相关病毒整合位点1(AAVS1)。 15.根据权利要求14所述的转基因哺乳动物细胞，其中，所述异源核酸插入于AAVS1基因座的1529和1530位之间、AAVS1基因座的2155和2156位之间、AAVS1基因座的2408和2409位之间或其组合。 16.根据权利要求13所述的转基因哺乳动物细胞，其中，所述转基因哺乳动物细胞包含整合的所述异源核酸的第一端处的attL序列和整合的异源核酸分子的第二端处的attR序列。 17.根据权利要求13所述的转基因哺乳动物细胞，其中，所述异源核酸包含可操作地连接于所述异源基因的启动子。 18.根据权利要求13所述的转基因哺乳动物细胞，其中，所述异源核酸不包含编码抗生素抗性标记的基因、SV40序列或其组合。 19.根据权利要求13所述的转基因哺乳动物细胞，其中，所述异源基因包含病毒基因、报告子或其组合。 20.根据权利要求19所述的转基因哺乳动物细胞，其中所述异源基因包含病毒基因，并且哺乳动物细胞系支持具有所述病毒基因的缺失的单周期感染性病毒的复制。 21.根据权利要求19所述的转基因哺乳动物细胞，其中，所述病毒基因包含来自单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、单纯疱疹病毒-2(HSV-2)、巨细胞病毒、轮状病毒、天花、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼肠孤病毒、日本脑炎病毒、出血热病毒、麻疹病毒、流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、登革热病毒、寨卡病毒，SARS-CoV2的基因，或其组合。 22.根据权利要求19所述的转基因哺乳动物细胞，其中，所述病毒基因包含必需基因或必需基因和非必需基因的组合。 23.根据权利要求19所述的转基因哺乳动物细胞，其中，所述病毒基因包含HSV基因，并且所述HSV基因包含糖蛋白B，糖蛋白C，糖蛋白D，糖蛋白E，糖蛋白G，糖蛋白H，糖蛋白I，糖蛋白J，糖蛋白K，糖蛋白L，糖蛋白M，糖蛋白N、UL20、UL45、US9或其组合，或其组合。 24.根据权利要求23所述的转基因哺乳动物细胞，其中，细胞系支持具有包含HSV-2gD基因缺失的基因组的单周期感染性HSV-2或具有包含HSV-1gD基因缺失的基因组的单周期感染性HSV-1的复制。 25.根据权利要求13所述的转基因哺乳动物细胞，其中，所述哺乳动物细胞包含整合于所述靶基因座中的1-50个拷贝的所述异源核酸。 26.一种细胞系，包含根据权利要求13所述的转基因哺乳动物细胞。 27.一种生产转基因哺乳动物细胞的方法，所述转基因哺乳动物细胞包含稳定整合于所述转基因哺乳动物细胞的基因组的染色体上的靶基因座中的异源核酸，所述方法包括： 将权利要求1所述的基因修饰的哺乳动物细胞与以下接触： 包含异源基因和重组序列的异源核酸，所述重组序列包含来自噬菌体Bxb1的attP序列，和 编码噬菌体Bxb1整合酶和核定位序列的mRNA；和 通过由所述Bxb1整合酶介导的所述基因修饰的哺乳动物细胞中的Bxb1 attB序列和所述异源核酸中的attP序列之间的序列特异性重组，将所述异源核酸插入所述基因修饰的哺乳动物细胞中的所述靶基因座，以产生所述转基因哺乳动物细胞。 28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述attP序列具有GGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGTCTCAGTGGTGTACGGTACAAACC(SEQ ID NO.3)的序列。 29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述接触包括用所述异源核酸和所述mRNA转染所述基因修饰的哺乳动物细胞。 30.根据权利要求27所述的方法，其中，所述异源核酸包含启动子和可可选地可操作地连接至异源基因序列的选择性标记。 31.根据权利要求27所述的方法，其中，所述异源核酸还包含可操作地连接至异源基因序列的选择性标记。 32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述选择性标记包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)hisD基因序列。 33.根据权利要求27所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞是Vero细胞，并且所述靶基因座包含所述Vero细胞的基因组的第6染色体上的腺相关病毒整合位点1(AAVS1)，其中所述异源核酸插入AAVS1基因座的1529和1530位之间、AAVS1基因座的2155和2156位之间、AAVS1基因座的2408和2409位之间，或其组合。 34.根据权利要求27所述的方法，其中，所述异源核酸不包含编码抗生素抗性标记的基因、SV40序列或其组合。 35.根据权利要求27所述的方法，其中，所述转基因哺乳动物细胞包含插入所述靶基因座中的1-50个拷贝的所述异源核酸。 36.根据权利要求27所述的方法，其中，所述异源基因包含病毒基因、报告子或其组合。 37.根据权利要求27所述的方法，其中，所述基因修饰的哺乳动物细胞通过包括以下的方法制备： 提供包含引导RNA和Cas9核酸内切酶的复合体，所述引导RNA包含与所述靶基因座上的靶位点杂交的寡核苷酸序列； 提供包含来自耻垢分枝杆菌的Bxb1 attB序列的单链DNA序列；和 将所述复合体和所述单链DNA序列引入所述哺乳动物细胞中以获得包含插入于所述靶基因座中的Bxb1 attB序列的哺乳动物细胞。 38.一种繁殖包含具有必需基因缺失的基因组的单周期感染性病毒的方法，所述方法包括： 提供转基因哺乳动物细胞，所述转基因哺乳动物细胞包含至少一个插入所述哺乳动物细胞基因组的染色体上的靶基因座中的必需基因的拷贝，其中所述转基因哺乳动物细胞组成型表达由所述必需基因编码的蛋白质； 使所述转基因哺乳动物细胞与所述单周期感染性病毒接触；和 用所述转基因哺乳动物细胞表达的蛋白质补充所述单周期感染性病毒以繁殖单周期病毒。 39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述接触包括在促进所述转基因哺乳动物细胞由所述单周期感染性病毒感染的条件下将所述单周期感染性病毒添加到所述转基因哺乳动物细胞中。 40.根据权利要求38所述的方法，其中，异源核酸还包含作为选择标记的hisD，并且所述方法还包括在包含组氨醇的选择培养基中并在适于使所述单周期感染性病毒的产量最大化的条件下培养所述转基因哺乳动物细胞一时间段。 41.根据权利要求38所述的方法，其中，所述单周期感染性病毒包括单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、单纯疱疹病毒-2(HSV-2)、巨细胞病毒、轮状病毒、天花、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼肠孤病毒、日本脑炎病毒、出血热病毒、麻疹病毒、流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、寨卡病毒、SARS-CoV2或其组合。 42.根据权利要求38所述的方法，其中，所述单周期感染性病毒是单周期感染型HSV-1或单周期感染型HSV-2，并且其中所述必需基因包括糖蛋白B，糖蛋白C，糖蛋白D，糖蛋白E，糖蛋白G，糖蛋白H，糖蛋白I，糖蛋白J，糖蛋白K，糖蛋白L，糖蛋白M，糖蛋白N、UL20、UL45、US9，或其组合。 43.一种用于检测和/或定量样品中的感染性病毒的方法，所述方法包括： 提供转基因哺乳动物细胞，所述转基因哺乳动物细胞包含稳定整合于所述哺乳动物细胞的基因组的染色体上的靶基因座中的异源核酸，其中所述异源核酸包含可操作地连接至报告子基因的病毒启动子； 使所述转基因哺乳动物细胞与所述样品接触，其中所述样品中存在的感染性病毒反式激活所述病毒启动子并诱导所述报告子基因在所述转基因哺乳动物细胞中的表达；和 量化表达由所述报告子基因编码的蛋白质的哺乳动物细胞的数量以量化所述感染性病毒。 44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述接触包括用所述样品中存在的病毒感染所述转基因哺乳动物细胞。 45.根据权利要求43所述的基于细胞的报告子试验，还包括检测所述报告子基因在所述转基因哺乳动物细胞中的表达。 46.根据权利要求43所述的基于细胞的报告子试验，其中，所述报告子编码荧光蛋白，所述荧光蛋白包括萤光素酶、纳米-Luc、β-内酰胺酶、碱性磷酸酶、绿色荧光蛋白、Venus、单体红外荧光蛋白(mIFP)、长斯托克斯位移单体橙(LssmOrange)、红色荧光蛋白(RFP)、标记红色荧光蛋白657(TagRFP657)、单体橙2(mOrange2)、单体Apple(mApple)、Sapphire、单体标记蓝荧光蛋白(mTagBFP2)、tdTomato、单体Cherry(mCherry)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、单体铈蓝3(mCerulean3)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白质(EGFP)或其组合。 47.根据权利要求43所述的方法，其中，所述样品是来自受试者的生物样品或取自大量病毒的批次的样品。 48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述生物样品包括血清、唾液、血浆、全血、鼻咽拭子、尿液、粪便、呼吸液、脑脊液或其组合。