3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其在甾体C1,2位脱氢药物中间体合成中的应用
本发明提供了一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体及其在甾体C1,2位脱氢药物中间体合成中的应用。具体地，本发明提供了一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体，且所述突变体具有将3‑酮基甾体化合物进行Δ1‑脱氢的活性，并且所述突变体在野生型的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶的一个或多个与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变。本发明的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体可以显著提高Δ1‑脱氢的活性，并且其重组菌可用于转化3‑酮基甾体化合物，以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，无副产物，转化率不低于94％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，制备方法简单方便、条件温和、环境友好，具有很好的产业化前景。
发明专利
CN202111668223.1
2021-12-31
CN116410939A
2023-07-11
C12N9/02(2006.01)
中国科学院天津工业生物技术研究所
马延和;王玉;张瑞;冯进辉;吴洽庆;朱敦明
300308 天津市滨海新区空港经济区西七道32号
天津;12
1.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体具有将3-酮基甾体化合物进行Δ1-脱氢的活性，并且所述突变体包括在一个或多个位点上的突变，所述的位点对应于野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶SEQ ID NO.:1的氨基酸1至530中的位点118、136、138、172、315、316、373、375和439，且与野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶氨基酸序列SEQ ID NO.:1具有至少90％同源性。 2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶来源于Sphaerimonospora thailandensis。 3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体具有如下序列中的一种： 1)在118位上的突变； 2)在136位上的突变； 3)在315位上的突变； 4)在373位上的突变； 5)在375位上的突变； 6)在439位上的突变； 7)在118位和136位上的组合突变； 8)在136位和138位上的组合突变； 9)在136位和316位上的组合突变； 10)在136位和375位上的组合突变； 11)在136位和439位上的组合突变； 12)在375位和439位上的组合突变； 13)在118位和136位和373位上的组合突变； 14)在118位和136位和375位上的组合突变； 15)在136位和315位和439位上的组合突变； 16)在136位和373位和439位上的组合突变； 17)在316位和375位和439位上的组合突变； 18)在118位和136位和373位和439位上的组合突变； 19)在118位和136位和315位和439位上的组合突变； 20)在118位和136位和316位和373位和439位上的组合突变； 21)在118位和172位和316位和375位和439位上的组合突变。 4.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，对应于SEQ ID NO.:1上的位点118的氨基酸由酪氨酸(Y)突变为组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、赖氨酸(K)，优选组氨酸(H)； 对应于SEQ ID NO.:1上的位点136的氨基酸由组氨酸(H)突变为丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、天门冬酰胺(N)、苏氨酸(S)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、半胱氨酸(C)，优选丙氨酸(A)； 对应于SEQ ID NO.:1上的位点138的氨基酸由甲硫氨酸(M)突变为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)，优选异亮氨酸(I)； 对应于SEQ ID NO.:1上的位点172的氨基酸由缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)，优选异亮氨酸(I)； 对应于SEQ ID NO.:1上的位点315的氨基酸由亮氨酸(L)突变为苏氨酸(T)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)，优选苏氨酸(T)； 对应于SEQ ID NO.:1上的位点316的氨基酸由色氨酸(W)突变为丙氨酸(A)、天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)，优选丙氨酸(A)； 对应于SEQ ID NO.:1上的位点373的氨基酸由丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)，优选丙氨酸(A)； 对应于SEQ ID NO.:1上的位点375的氨基酸由丝氨酸(S)突变为组氨酸(H)、天门冬酰胺(N)、甘氨酸(G)，优选组氨酸(H)； 对应于SEQ ID NO.:1上的位点439的氨基酸由丙氨酸(A)突变为苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、丝氨酸(S)，优选苯丙氨酸(F)。 5.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1-4任一所述的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。 6.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体含有权利要求5所述的多核苷酸。 7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的载体，或其基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。 8.一种制备C1,2位脱氢甾体化合物的方法，其特征在于，将如权利要求1所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体作用于3-酮基甾体化合物，同时加入电子受体，优选地电子受体是吩嗪硫酸甲酯，进行转化反应得到C1,2位脱氢甾体化合物。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述3-酮基甾体化合物为通式I所示的甾体化合物： 其中R1为H，OH，OAc； R2为H，OH；R3为H，或者R2，R3为双键； R4为H，＝O，β-OH，R5为H或者R4，R5为双键； R6为H，CH3。