A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT-PCR检测的核酸、试剂盒及检测方法
本发明属于微生物技术领域，公开了A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT‑PCR检测的核酸、试剂盒及检测方法。检测的基因型包括G1、G2、G3、G4、G8、G9、P[4]、P[6]和P[8]，进行分组检测，每组中至少检测两种基因型，优选分三组检测，其中G1、G9、P[6]为A组，G2、G4、P[4]为B组，G3、G8、P[8]为C组。本方法能够快速高效地检测出A组轮状病毒的9种基因型，可以有效地节约稀少样本，同时节省试剂，具有较高的灵敏度和特异性，结果判读简单，应用方便，为A组轮状病毒分型的特异性检测及A组轮状病毒的防控提供参考。
发明专利
CN202111400473.7
2021-11-24
CN116162732A
2023-05-26
C12Q1/70(2006.01)
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
段招军;李丹地;王明雯;毛彤瑶
102206 北京市昌平区昌百路155号
北京元中知识产权代理有限责任公司
卢雪梅
北京;11
1.用于A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT-PCR检测的核酸，其特征在于，检测的基因型包括G1、G2、G3、G4、G8、G9、P[4]、P[6]和P[8]，进行分组检测，每组中至少检测两种基因型，其中： 用于检测G1基因型的第一引物对和第一探针，所述第一引物对的核酸序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示；所述第一探针的核酸序列如SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示，荧光标记为5’FAM，3’MGB； 用于检测G9基因型的第二引物对和第二探针，所述第二引物对的核酸序列如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示；所述第二探针的核酸序列如SEQ ID NO:7所示，荧光标记为5’VIC，3’MGB； 用于检测P[6]基因型的第三引物对和第三探针，所述第三引物对的核酸序列如SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9所示；所述第三探针的核酸序列如SEQ ID NO:10所示，荧光标记为5’CY5，3’MGB； 用于检测G2基因型的第四引物对和第四探针，所述第四引物对的核酸序列如SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示；所述第四探针的核酸序列如SEQ ID NO:13所示，荧光标记为5’VIC，3’BHQ-1； 用于检测G4基因型的第五引物对和第五探针，所述第五引物对的核酸序列如SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:15所示；所述第五探针的核酸序列如SEQ ID NO:16所示，荧光标记为5’CY5，3’BHQ-2； 用于检测P[4]基因型的第六引物对和第六探针，所述第六引物对的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO:19所示；所述第六探针的核酸序列如SEQ ID NO:20和/或SEQ ID NO:21所示，荧光标记为5’FAM，3’BHQ-1； 用于检测G3基因型的第七引物对和第七探针，所述第七引物对的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO:22所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO:23和/或SEQ ID NO:24所示；所述第七探针的核酸序列如SEQ ID NO:25所示，荧光标记为5’FAM，3’MGB； 用于检测G8基因型的第八引物对和第八探针，所述第八引物对的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO:26和/或SEQ ID NO:27所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO:28所示；所述第八探针的核酸序列如SEQ ID NO:29所示，荧光标记为5’CY5，3’MGB； 用于检测P[8]基因型的第九引物对和第九探针，所述第九引物对的核酸序列如SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31所示；所述第九探针的核酸序列如SEQ ID NO:32所示，荧光标记为5’VIC，3’MGB； 优选的，进行分组检测，每组中检测2～4种基因型； 优选的，分为三组检测，G1、G9、P[6]为A组，G2、G4、P[4]为B组，G3、G8、P[8]为C组。 2.一种用于A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于，试剂盒的组分中包括如权利要求1中所述的检测G1、G2、G3、G4、G8、G9、P[4]、P[6]和P[8]基因型的核酸。 3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括含有G1、G2、G3、G4、G8、G9、P[4]、P[6]和P[8]基因型的目的序列的质控品，所述质控品的核酸序列如SEQ IDNO:33所示； 优选的，所述试剂盒中还包括Premix EX TaqTM； 或者，所述试剂盒中还包括qRT-PCR buffer和qRT-PCR Enzyme。 4.一种A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)提取待测样品的RNA备用； (2)准备设定浓度的含有G1、G2、G3、G4、G8、G9、P[4]、P[6]和P[8]基因型的目的序列的RNA标准品； (3)分别以待检测样品的RNA和RNA标准品为模板，采用权利要求1中所述的用于检测G1、G2、G3、G4、G8、G9、P[4]、P[6]和P[8]基因型的核酸，分组进行多重实时荧光定量RT-PCR检测，根据RNA标准品的检测结果绘制各基因型标准曲线，确定各基因型最低检出限； (4)解读待测样品的结果； 优选的，进行分组检测，每组中检测2～4种基因型； 优选的，分为三组检测，G1、G9、P[6]为A组，G2、G4、P[4]为B组，G3、G8、P[8]为C组，每组中加入相对应基因型的引物和探针。 5.根据权利要求4所述的A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中，将G1、G2、G3、G4、G8、G9、P[4]、P[6]和P[8]基因型的目的序列重组拼接，重组序列为如SEQ ID NO:33所示，克隆到pGEM-T载体上，得到重组质粒，进行质粒扩增、扩增产物纯化后进行体外转录及纯化，得到RNA标准品，所述RNA标准品的核酸序列与重组序列相同，如SEQ ID NO:33所示。 6.根据权利要求4所述的A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，多重实时荧光定量RT-PCR的反应体系中，各基因型的上游引物和下游引物的终浓度为200-400nM； 优选的，各基因型的上游引物和下游引物的终浓度为200nM。 7.根据权利要求4所述的A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，各基因型的探针的终浓度为100-200nM； 优选的，各基因型的探针的终浓度为100nM。 8.根据权利要求4所述的A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，模板的体积为2.5-5μL； 优选的，模板的体积为5μL。 9.根据权利要求4所述的A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，多重实时荧光定量RT-PCR的反应条件包括： 48-55℃逆转录10-15min，95℃RT-PCR起始活化20-40s，95℃变性10-20s，55-60℃退火延伸30-60s，进行35-45个循环，每个循环后收集荧光信号； 优选的，多重实时荧光定量RT-PCR的反应条件为：53℃逆转录15min，95℃起始活化30s，95℃变性10s，58℃退火和延伸45s，进行40个循环，每个循环后检测荧光信号。 10.根据权利要求4-9任意一项所述的A组轮状病毒基因分型的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤(4)中，解读待测样品的结果的方法包括： 若待测样本检测结果CT≤35，曲线呈S型且有明显指数增长期，判断为核酸检测阳性； 若待测样本检测结果35＜CT≤38，此时样本进行重复检测，如重读结果CT值仍在35-38范围内，曲线呈S型且有明显指数增长期，则判断为核酸检测阳性，否则为阴性； 若待测样本检测结果CT＞38或未检出，此次结果判断为核酸检测阴性。