PMA与微滴式数字PCR结合定量检测食品中副溶血性弧菌活细胞菌的方法

摘要：

本发明公开了PMA与微滴式数字PCR结合定量检测食品中副溶血性弧菌活细胞菌的方法，包括如下步骤：（1）样品采集与处理；（2）待测样品DNA提取；（3）采用ddPCR扩增引物及探针引物对副溶血性弧菌tlh基因进行检测。本发明的引物特异性强，灵敏度高，准确性高，可准确定量，检测快速，由于采用分子基因扩增技术，无须经过传统的培养增菌过程，整体检测过程只需3‑4h内完成，检测结果与传统平板计数方法基本一致，检测时间缩短了3‑5d。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN201810951119.5

申请日期：2018-08-21

公开/公告号：CN109022549A

公开/公告日：2018-12-18

主分类号：C12Q1/6851(2018.01)I

申请/专利权人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心%广州双螺旋基因技术有限公司

发明/设计人:翁文川;谢会;袁幕云;凌莉;常彦磊;谢淑媚

主申请人地址:510623 广东省广州市天河区珠江新城花城大道66号

专利代理机构:广州市深研专利事务所 44229

代理人:姜若天

国别省市代码:广东;44

权利要求：

1.一种PMA与微滴式数字PCR结合定量检测食品中副溶血性弧菌活细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）样品采集与处理：PMA处理待测样品：取食品样品，加入APW后均质，取均质液12000r/min下离心，弃上清液，向沉淀中加入去离子水，振荡至沉淀悬浮且分散均匀，加入终浓度为16μg/mL的PMA后混匀，避光孵育，使用核酸光标记仪曝光；（2）待测样品DNA提取：采用Chelex‑100法提取菌悬液DNA：取PMA处理后的菌悬液至灭菌离心管，12000r/min下离心，弃上清，于沉淀中加入10％Chelex‑100溶液，剧烈振荡5~10s；56℃水浴 30min，取出振荡，95℃加热10 min，剧烈振荡5~10s；12000r/min下离心5min，取上清液作为DNA模板；（3）采用ddPCR扩增引物及探针引物对副溶血性弧菌tlh基因进行检测：a）ddPCR反应体系设置为20μL，其中包括:2×Supermix 10μL，正反向引物各1.5μL，10μmol/L，探针引物0.5μL，10μmol/L，DNA模板4μL，无菌超纯水补足至20μL；b）反应条件设置为：95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，共40个循环；98℃ 10 min；4℃；c）ddPCR反应结束后将96孔板放入QX200Droplet Reader，在软件QuantaSoft里依次录入样品信息后点击运行，仪器自动采集荧光信号，运行完毕后自动计算出最终结果；d）引物序列为：tlh2‑F：CACAATGGCGCTTCCCTAAC；tlh2‑R：GCGCGATGTATTGGTTCTCA；tlh2‑P：FAM‑AAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCA‑BHQ。