CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法

摘要：

本发明公开了涉及一种CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法；包括如下步骤：确定notch1a基因敲除的靶点位置；以pUC19‑gRNA scaffold质粒为模板，使用引物T7‑notch1a‑sfd、tracr rev进行PCR扩增；PCR产物纯化、体外转录获得gRNA；将gRNA与Cas9mRNA导入斑马鱼胚胎中，培养获得稳定遗传的notch1a突变体。本发明利用CRISPR/Cas9技术，通过选择一段独特的打靶区，使得斑马鱼中的notch1a被敲除，又不“误伤”其他基因，形成notch1a基因敲除的斑马鱼；另外，本发明还公开了notch1a基因缺失斑马鱼突变体的表型，对于研究Notch信号通路中Notch1a受体的作用意义重大。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN201810527941.9

申请日期：2018-05-28

公开/公告号：CN108823249A

公开/公告日：2018-11-16

主分类号：C12N15/90(2006.01)I

申请/专利权人:上海海洋大学

发明/设计人:张庆华;季策;董雪红;张秋月;岳倩文;李伟明

主申请人地址:201306 上海市浦东新区沪城环路999号

专利代理机构:上海伯瑞杰知识产权代理有限公司 31227

代理人:曹莉

国别省市代码:上海;31

权利要求：

1.一种斑马鱼notchla突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、确定notchla基因敲除的靶点在斑马鱼notchla的基因序列的第16个外显子上；S2、根据步骤S1确定的靶点序列设计扩增引物；S3、以pUC19‑gRNA scaffold质粒为模板，使用引物T7‑notchla‑sfd、tracr rev进行PCR扩增；S4、对步骤S3的PCR产物进行体外转录，纯化获得gRNA；S5、以pXT7‑hCas9质粒为模板，体外转录合成Cas9 mRNA；S6、将gRNA与Cas9 mRNA导入斑马鱼一细胞期胚胎中；S7、培养获得稳定遗传的斑马鱼notchla突变体。