CRISPR/Cas9技术介导miR167前体序列编辑体系的建立方法

摘要：

本发明提供了一种CRISPR/Cas9技术介导miR167前体序列编辑体系的建立方法，步骤包括：A、gRNA设计和体外验证：利用在线软件设计后选择评分较高的多个靶标位点，序列合成后使用体外酶切检测的方法来筛选合适的gRNA，通过聚合酶将软件设计出的靶标位点序列在体外转录生成gRNA，再利用Cas9核酸酶体外切割的方法来验证gRNA‑Cas9的体外切割效率，从而筛选出目的gRNA；B、载体构建：构建CRISPR/Cas9表达系统的两个载体pP1C.5和pP1C.1；本发明的主要目的是在CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用过程中，更方便和高效地获得目标靶基因的合适gRNA，并且在转基因植株的检测过程中，更加直观地检测到CRISPR/Cas9载体的转入，降低转基因植株筛选的工作量，节约时间，提高效率。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN201710698186.6

申请日期：2017-08-15

公开/公告号：CN107815463A

公开/公告日：2018-03-20

主分类号：C12N15/82(2006.01)I

申请/专利权人:西南大学

发明/设计人:王小柯;江东

主申请人地址:400712 重庆市北碚区歇马镇西南大学柑桔研究所

专利代理机构:北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246

代理人:夏艳

国别省市代码:重庆;85

权利要求：

CRISPR/Cas9技术介导miR167前体序列编辑体系的建立方法，其特征在于，步骤包括：A、gRNA设计和体外验证：利用在线软件设计后选择评分较高的多个靶标位点，序列合成后使用体外酶切检测的方法来筛选合适的gRNA，通过T7RNA聚合酶将软件设计出的靶标位点序列在体外转录生成gRNA，再利用Cas9核酸酶体外切割的方法来验证gRNA‑Cas9的体外切割效率，从而筛选出目的gRNA；B、载体构建：构建CRISPR/Cas9表达系统的两个载体pP1C.5和pP1C.1通过pUC19载体改造pP1C.5载体，使其含有AtU6启动子驱动的gRNA插入位点和sgRNA scaffold；通过pCAMBIA1302载体改造pP1C.1载体，使其含有CaMV 35S启动子驱动的Cas9，同时含有hptⅡ潮霉素筛选位点，并将潮霉素筛选位点替换成卡那霉素筛选位点，并加上CFP荧光蛋白的基因，重新命名为pP1C.1C。