一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法。本发明一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，大致包括1）提取基因组DNA；2）评估原始引物（单对引物）扩增产物的片段大小；3）设计并优化三重PCR引物组合；4）三重PCR扩增及条件优化；5）基因分型效果检测并确定最终组合方式。本发明大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法简单，与大熊猫常规的微卫星PCR体系相比，节约66.7%的DNA样本、66.7%的成本、效率提高了200%。本发明可在大熊猫的亲子鉴定、种群遗传多样性和遗传结构的评估方面进行推广。
发明专利
CN201710626400.7
2017-07-27
CN107190098A
2017-09-22
C12Q1/68(2006.01)I
四川省自然资源科学研究院%中国大熊猫保护研究中心
朱英;杨海琼;李裕冬;熊铁一
610044 四川省成都市一环路南2段24号
成都金英专利代理事务所(普通合伙) 51218
袁英
四川;51
一套大熊猫微卫星位点的三重PCR体系检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a、DNA样品提取：采用Axygen血液基因组提取试剂盒对大熊猫血液基因组DNA进行提取；b、评估引物的扩增产物的大小：从文献中选择15对大熊猫微卫星引物，分别为Gpz6，Gpz47，Gpz20，Gpl47，Gpl29，Gpl60，Gpz54，Gpl8，Gpl31，Gpl44，Gpz51，Gpl28，Gpl53，Gpy20，Gpy5，在上述15对引物上游的5’端加入接头序列5’‑CACGACGTTGTAAAACGAC‑3’，引物合成后，分别对大熊猫DNA进行单重PCR扩增，对扩增后的PCR产物按照150～200bp，200～250bp，250bp以上三个不同区间进行初步分组；c、引物优化：采用Primer Premier 6.0重新设计引物使得扩增产物长度符合要求，且引物组合需使得三个片段区域各包含5对引物；d、引物组合评估：利用Primer Premier 6.0进行引物间的评估，选择两两引物之间ΔdG<4.0的引物组合备用；e、三重PCR体系：对d步骤选择的三重PCR组合均采用10μL PCR体系；f、三重PCR扩增条件优化：采用降落PCR程序实施三重PCR；g、基因分型：取1uLPCR产物在7%的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，激光扫描检测目的产物。