H3K27me3及其去甲基化酶KDM6A/B在小鼠核移植重构胚中的应用方法
本发明公开了一种H3K27me3及其去甲基化酶KDM6A/B在小鼠核移植重构胚中的应用方法，分析了植入前各时期孤雌胚胎中H3K27三甲基化模式与克隆胚胎有何差异，这种模式的差异对克隆胚胎发育能力的影响，证实了通过对KDM6A和KDM6B的微调能提高克隆胚胎的囊胚发育率及克隆动物的出生率。
发明专利
CN201710439507.0
2017-06-12
CN107299113A
2017-10-27
C12N15/877(2010.01)I
内蒙古大学
刘雪霏;杨磊;李光鹏
010000 内蒙古自治区呼和浩特市赛罕区大学西路235号
北京华仲龙腾专利代理事务所(普通合伙) 11548
李静
内蒙古;15
一种H3K27me3及其去甲基化酶KDM6A/B在小鼠核移植重构胚中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：1)准备实验动物：使用Oct4启动子‑绿色荧光转基因小鼠作为活细胞成像时卵母细胞的供体小鼠(OG2)；2)收集MII时期卵母细胞：3)准备实验试剂：3.1)胚胎培养液：3.2)免疫荧光及免疫印迹相关主要试剂：4％多聚甲醛液、聚乙二醇辛基苯基醚、磷酸盐缓冲生理盐水、吐温20、DAPI染料、抗体Oct4、抗体Nanog、抗体SSEA1、抗体Sox2、抗体H3K27me3、抗体KDM6A、抗体KDM6B、RNA提取试剂盒、实时荧光定量PCR；4)定量引物4.1)KDM6A，引物序列为：forward‑TATTGGCCCAGGTGACTGTGAAreverse‑CAGATCTCCAGGTCGCTGAATAAAC4.2)KDM6B，引物序列为：forward‑GCTGGAGTGCTTGTTCCATGAGreverse‑GAAAGCCAATCATCACCCTTGTC4.3)Gapdh，引物序列为：forward‑AAAATGGTGAAGGTCGGTGTGreverse‑AATGAAGGGGTCGTTGATGG5)实验方法5.1)MII期卵母细胞孤雌激活5.2)siRNA显微注射用无核酸酶的TE缓冲液分别将siRNA‑KDM6A、siRNA‑KDM6B和siRNA‑对照组稀释至40mM，使用显微操作臂将稀释后的液体通过显微注射针缓慢注入卵母细胞的胞质当中，注射后的卵母细胞室温恢复15min后转移至KSOM培养液，置于37℃培养箱中2h；5.3)实时定量PCR，按照定量说明书建议，进行试验；5.4)免疫荧光染色5.4.1)胚胎固定：将胚胎放入质量分数为4％的多聚甲醛固定液中，室温60min或4℃条件下固定过夜；5.4.2)通透：将固定后的胚胎用1ml磷酸盐缓冲生理盐水清洗一遍，移入质量分数为0.5％聚乙二醇辛基苯基醚溶液室温处理15min；5.4.3)封闭：将胚胎放入含质量分数为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为1％的牛血清白蛋白溶液中室温封闭30min；5.4.4)抗体孵育：将胚胎移入经稀释液稀释过的抗体中37℃孵育1h，稀释液含质量分数为1％的吐温20和质量分数为1％的牛血清白蛋白，孵育后用磷酸盐缓冲生理盐水漂洗3次，每次5min，加入封闭液稀释的抗体溶液，封闭液含质量分数为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚和质量分数为1％的牛血清白蛋白溶液，室温避光孵育1h后用磷酸盐缓冲生理盐水避光漂洗3次，每次5min；5.4.5)DAPI染色：将胚胎室温避光染色15min，用磷酸盐缓冲生理盐水避光漂洗3次，每次5min；5.4.6)封片：加一滴抗淬火剂于载玻片上，将染色后的胚胎移入抗粹灭剂中，覆盖盖玻片后封片剂封片；5.4.7)共聚焦成像：使用Nikon A1R共聚焦显微镜采集图像；5.5)活细胞成像：显微注射siRNA后的卵母细胞，经孤雌激活6h后，培养于Nikon Ti‑E加装活细胞成像系统，并用488nm激光扫描，由Nikon A1R相机扫描成像；5.6)数据统计与分析。