hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法

摘要：

hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，包括以下步骤：步骤一、原代人牙周膜干细胞(hPDLSC)的培养：步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化基因工程细胞系hTERT-PDLSC构建：本发明利用表达hTERT基因的慢病毒载体，在一定条件下将其感染原代培养的PDLSC，经过嘌呤霉素的抗性筛选，得到稳定表达hTERT基因的永生化细胞系，能够将细胞使用寿命从3-8代延长至35代，得到性质稳定、功能良好、表型正常的永生化细胞模型；本发明在研究牙周膜干细胞对于牙周组织工程、研发有效的治疗牙周炎的药物方面具有有益效果。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN201510256715.8

申请日期：2015-05-19

公开/公告号：CN104928319A

公开/公告日：2015-09-23

主分类号：C12N15/867(2006.01)I

申请/专利权人:西安交通大学

发明/设计人:李昂;刘瑾;苟建重;王嗣岑

主申请人地址:710049 陕西省西安市咸宁路28号

专利代理机构:西安智大知识产权代理事务所 61215

代理人:弋才富

国别省市代码:陕西;61

权利要求：

hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、原代人牙周膜干细胞(hPDLSC)的培养：收集拔除的前磨牙，刮取牙根中1/3牙周膜组织，800rpm离心5min后，沉淀中并按照1个牙取得的组织都加1mL Ⅰ型胶原酶吹打混匀，置于37℃,5％CO₂,饱和湿度的标准环境细胞培养箱消化至组织松散，每隔3‑5d更换正常培养液一次，正常培养液成分为：体积比79％的DMEM/F12培养基中加入体积比为20％的胎牛血清，体积比为1％的三抗混匀，待有细胞克隆出现，用滤纸片挑取细胞克隆扩大培养，扩大培养的方式是消毒干燥的滤纸片沾湿0.2％胰酶后于克隆位置消化5‑10秒，利用滤纸片将消化下的细胞转移至新的培养皿中继续培养，得到的第3代生长状态佳的人牙周膜干细胞hPDLSC为长梭形、呈放射状生长；步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化基因工程细胞系hTERT‑PDLSC构建：取步骤一培养得到的第3代生长状态佳的hPDLSC消化后接种于24孔板，每孔500μL；24h后待细胞贴壁生长，然后再在每孔中加增强感染效率的试剂Enhanced infection solution ENi.S.原液243.25μL、10mg/mL聚凝胺polybrene 0.25μL，以及按照MOI＝65加入携带hTERT基因1*10⁵TU/μL的慢病毒原液6.5μL，混合均匀混合均匀；24h后换正常培养液，2d后再换含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基，隔2d用含2μg/mL嘌呤霉素的培养基再换1次，培养观察4d，待未感染细胞在嘌呤霉素作用下全部死亡，再换正常培养基静置培养，每3d换液1次；直到有抗性细胞克隆出现，滤纸片挑取克隆进行扩大培养，得到稳定的感染细胞为长梭形。