FMDV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法
本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体涉及一种FMDV（口蹄疫病毒）通用型和O型二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法。该方法包括引物设计、总RNA的制备、反转录、FMDV通用型和O型标准品的制备、二重FQ-PCR反应、结果判定等步骤。本发明所提供的FMDV-T/FMDV-O二重TaqManMGBFQ-PCR检测方法可实现一个反应同时对通用型和O型FMDV进行快速鉴别检测，可在1h～2h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测FMDV的要求。
发明专利
CN201410755420.0
2014-12-11
CN104388597A
2015-03-04
C12Q1/70(2006.01)I
河南省动物疫病预防控制中心
闫若潜;吴志明;王淑娟;赵雪丽;刘梅芬;方先珍;马震原;刘琨;李少阳;张林海;董海岚;郭小玲;曹伟伟;肖锦红;郭瑞英
450008 河南省郑州市金水区经三路91号
郑州联科专利事务所(普通合伙) 41104
时立新
河南;41
一种FDMV通用型和O型二重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：<b>（1）引物设计</b>引物序列包括一条特异性反转录引物FMDVR P0，两对特异性引物对FMDVT‑F P1、FMDVT‑R P2 、FMDVO‑F P3、FMDVO‑R P4，两条TaqMan MGB探针FMDVT‑MGB‑FAM‑Probe Probe‑P5、FMDVO‑MGB‑VIC‑Probe Probe‑P6，具体序列如下：P0：cgggaaacgcatgagcagta，P1：cggcctctcatccaacaga，P2：attttccttcaggcgcttga，P3：gcgcgctcctccgtact，P4：cgtgtttcactgccacttctaga，Probe‑P5：5'‑FAM‑ tcatttgtgaaacgcg ‑MGB‑3' ，Probe‑ P6：5'‑ VIC‑ ccacctactacttcgca ‑MGB ‑3'；<b>（2）总RNA的制备</b>以口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型细胞灭活病毒标准株单一培养物的等量混合物为阳性对照，正常BHK‑21细胞培养物为阴性对照，与待检样品同时采用Trizol法提取总RNA；<b>（3）反转录</b>将步骤（2）中所提取的总RNA分别进行反转录；<b>（4）FMDV通用型和O型标准品的制备</b>将含有FMDV‑T基因片段和FMDV‑O基因片段的阳性扩增产物分别连接入pGEM‑T Easy载体，培养、鉴定，将测序正确的pGEM‑T/ FMDV‑T 和pGEM‑T/ FMDV‑O重组质粒，测定并确定质粒DNA的浓度和纯度，－20℃保存备用；<b>（5）口蹄疫病毒通用型和O型二重FQ‑PCR反应条件 </b>将步骤（4）所得的pGEM‑T/ FMDV‑T 和pGEM‑T/ FMDV‑O重组质粒分别稀释作为检测模板，对照组和待检测样品分别进行荧光定量PCR反应；<b>（6）结果判定</b>阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准；在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式下阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞40.0或无；阳性对照的Ct值应≤35.0，且出现两条特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效；检测结果成立的前提下，若样品在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式Ct值≤35.0，而且出现两条特定的扩增曲线，表明样品中存在口蹄疫病毒并且为O型；若样品在“FAM/NONE”或“VIC/NONE”标记模式下出现Ct值≤35.0，而且出现一条特定的扩增曲线，表明样品中存在口蹄疫病毒，但不是O型；Ct值＞38.0或无，并且无特定的扩增曲线，并且阳性对照的Ct值≤35.0，则判定为阴性；38.0≥Ct值＞35.0且有特定的扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。