miR-193实时荧光定量PCR检测方法
本发明公开了一种miR-193实时荧光定量PCR检测方法，包括血清中总RNA的提取步骤、逆转录合成cDNA反应、荧光定量PCR扩增反应、荧光定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳等步骤。本发明易操作、准确，所采用的实时荧光定量PCR检测方法，巧妙的运用PCR技术的DNA高效扩增，高效、灵敏的检测miR-193。
发明专利
CN201410617068.4
2014-11-06
CN104357567A
2015-02-18
C12Q1/68(2006.01)I
南通大学附属医院
鞠少卿;申娴娟;赵虬旻;施维;戚菁;吴信华;丛辉
226001 江苏省南通市西寺路20号
南通市永通专利事务所 32100
葛雷
江苏;32
一种miR‑193实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：包括下列步骤：（1）血清中总RNA的提取步骤：无菌吸取300 μl血清样本于2.0 ml的EP管中，向样本中加入300 μl 2×变性溶液，室温下混合均匀后冰上孵育5 min；再向混合液中加入600 μl酸化的酚‑氯仿，涡旋震荡60 s，常温下20,000 g，离心10 min，直至界面被压缩；然后移取上层水相约500 μl于新的1.5 ml EP管中；同时向移取的水相液体中加入625 μl无水乙醇，混合均匀备用；接着将试剂盒提供的过滤柱和收集管依次组装完毕，并做好标记；将先前加入625 μl无水乙醇的水相液体混合液移取至过滤柱中，12,000 g，离心30 s，弃液，保留收集管；然后向复位的过滤柱中加入700 μl总RNA提取试剂盒的miRNA 洗涤液 1，12,000 g，离心15 s；向再复位的过滤柱中加入500 μl总RNA提取试剂盒的洗涤液2、3，12,000 g，离心15 s，弃液，保留收集管，空管12,000 g，离心1 min，然后弃掉收集管及管中所有液体，并将过滤柱安装至新的收集管中，接下来向过滤柱中加入30～100 μl预热的洗脱液， 12,000 g，离心30 s；收集管中的液体即是回收的总RNA，采用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度及纯度，取吸光度值A260/A280在1.8～2.1用于实验；（2）逆转录合成cDNA 反应体系：RNA 模板2 μg，逆转录酶 2 μl，双蒸水补足至11 μl，混匀离心，70℃放置10 min，冰育2 min，再加入以下试剂：逆转录缓冲液（5×）5 μl，脱氧核糖核苷三磷酸混合液2 μl，40 U/μl 的RNA酶抑制剂0.5 μl，200 U/μl的逆转录酶0.5 μl，双蒸水补足至25 μl，混匀，42℃ 60 min，70℃ 10 min；合成的cDNA放‑80℃冰箱保存备用；（3）荧光定量 PCR扩增反应：反应体系：MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×）22.5 μl，正反向miRNA 茎环引物各5 μl，逆转录PCR产物2 μl ，不含RNA酶的H2O补足至50 μl；95℃预变性20 s，1个循环；95℃ 10 s，60℃ 20 s，70℃ 31 s，40个循环；每管设立三个复孔；（4）荧光定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳：因miR‑193和内参U6分子量小，所以PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，且随时观察，防止分子跑出胶外。