L-肉碱脱氢酶的提纯方法
本发明公开了一种L-肉碱脱氢酶的提取与纯化方法，包括制备L-肉碱脱氢酶粗酶液，硫酸铵分级盐析和DEAE-cellulose离子交换层析步骤。经过本发明处理后，L-肉碱脱氢酶被初步提纯，纯化倍数达到104.7倍，酶活7.49U/ml，比活达到2.848U/mg。
发明专利
CN201310378666.6
2013-08-27
CN103436503A
2013-12-11
C12N9/04(2006.01)I
宁波赛克生物技术有限公司
钱江;马晓航;钱峰;张鹏程
315400 浙江省宁波市余姚市三七市镇云山工业园区
余姚德盛专利代理事务所(普通合伙) 33239
胡小永
浙江;33
L‑肉碱脱氢酶的提取与纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）L‑肉碱脱氢酶粗酶液的获得：①菌株发酵：菌株活化：将Ochrobactrum属的一株能产优良性质的L‑肉碱脱氢酶(EC1.1.1.108)的菌株L‑3菌株接入斜面培养基30℃培养20‑30h进行活化；一级培养：再将活化后的菌株接一环到液体培养基，培养条件为：100mL锥形瓶中装液20mL，30℃，摇床转数180rpm，培养24小时；二级培养：然后以1%的接种量将菌液加入到液体培养基中，在与一级培养相同培养条件下培养24h；三级培养，15L发酵罐中装10L的液体培养基发酵27h，发酵的条件：发酵温度30℃，搅拌速度180rpm，pH6.5；②发酵液的浓缩处理将发酵结束后的发酵液8000rpm离心30min收集菌体，并用50mmol/L，pH7.0的PB缓冲液洗涤细胞一次；洗涤完之后，将所得的菌体悬浮于500mLPB缓冲液中，用高压均质机进行破壁，之后8000rpm离心30min去除细胞壁碎片，即得粗酶液，4℃下保存；（2）L‑肉碱脱氢酶的纯化①硫酸铵分级盐析在所述粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末，使饱和度分别达到35%、45%、55%、65%，同时不断调节pH使其稳定在7.0，盐析过夜，在每个浓度都将 粗酶液以8000rpm离心30min，在沉淀中以1：2的比例加入50mmol/L，pH7.0的PB缓冲液后测酶活和蛋白含量，将比活较高的部分收集起来装入透析袋，用0.01mol/L，pH8.0的Tris‑HCl缓冲液与4℃下透析，每隔12小时换一次透析液，换三次；透析结束后8000rpm离心30分钟取上清以用于下一步的纯化；②DEAE‑cellulose离子交换层析DEAE‑cellulose层析柱（5.5×50cm）先用0.01mol/L，pH8.0的Tris‑HCl缓冲液平衡，再将透析后的酶液上此离子交换柱，用NaCl浓度为0到1mol/L的0.01mol/L，pH8.0的Tris‑HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，15min收集一管；用Folin‑酚法测定各管蛋白含量和测定各管酶活；将比活较高的几管收集合并。