miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法

摘要：

本发明公开了一种miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法，包括人胰腺癌细胞系PANC-l培养、流式细胞仪检测和分选胰腺癌干细胞、无血清悬浮培养PANC-l干细胞球细胞、过表达miR-200a。本发明操作方便，效果好，成本低。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN201310027873.7

申请日期：2013-01-24

公开/公告号：CN103074301A

公开/公告日：2013-05-01

主分类号：C12N5/095(2010.01)I

申请/专利权人:南通大学附属医院

发明/设计人:陆玉华;王志伟;朱铭岩;陆晶晶;李晓红;朱慧;范向军;朱沙俊;王雷;鞠少卿;吴信华

主申请人地址:226001 江苏省南通市西寺路20号

专利代理机构:南通市永通专利事务所 32100

代理人:葛雷

国别省市代码:江苏;32

权利要求：

一种miR‑200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法，其特征是：包括下列步骤：A）人胰腺癌细胞系PANC‑l培养以含10 ％胎牛血清的DMEM培养液为培养基，在37 ℃、5％ CO2饱和湿度条件下培养人胰腺癌细胞系PANC‑l，每2‑3天传代一次，每传代一次用 0.25 ％胰蛋白酶消化；B）流式细胞仪检测和分选胰腺癌干细胞（1）将PANC‑1癌细胞消化成单细胞悬液细胞生长达对数生长期后，吸去培养液，PBS洗1遍，加入0.25 ％胰蛋白酶，37℃ 消化5 min；待细胞变圆，加入含血清的完全培养基，吸管吹打数次；移入无菌离心管，1000 r／min离心5 min，PBS液重悬细胞，血球计数板计数；（2）抗体孵育每1×106个细胞分别加入20 μl PE标记的抗人CD24、APC标记的抗人CD44和FITC标记的抗人ESA，稀释度均为1:40，冰浴30 min，PBS清洗2次；对照组不加抗体；应用流式细胞仪进行流式检测及分选，分选得到CD24+CD44+ESA+细胞亚群；C）无血清悬浮培养PANC‑l干细胞球细胞(1) 干细胞球的培养 将分选得到的CD24+CD44+ESA+细胞亚群用DMEM‑F12培养基重悬，在37℃、5％ CO2的培养条件下培养，当培养至第5‑7天时，形成球状；(2) 干细胞球的传代当干细胞球长至第10天左右，1000 r/min离心5 min，去上清，用0.25 ％胰蛋白酶消化3 min，加入胰酶抑制剂中和后吹打成单细胞悬液，接种于DMEM‑F12无血清培养基中继续培养，为第二代PANC‑l干细胞球，体外连续培养并传代；D）过表达miR‑200a（1）合成miR‑200a的前体片段和阴性对照；（2）取对数生长期细胞进行细胞转染，按照Invitrogen Lipofectamine 2000 说明书分别转染到胰腺癌干细胞中。