HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法
HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前新城疫的病毒疫苗存在成本高的问题。方法：一、以pNDV-F-T为模板PCR扩增，目的片段进行TA克隆及连接，得pTYL-HA-F，酶切得HA-F片段；二、六种质粒分别单酶切及去磷酸化处理，然后进行纯化；三、连接后得六种重组转移载体；四、转化感受态细胞，经提取后得Bacmid-YL；五、转染sf9细胞，得六种重组杆状病毒即完成。本发明利用杆状病毒表达系统，使其直接在中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1内表达HA-F抗原蛋白；为制备鸡新城疫基因工程疫苗奠定了基础，以此制备的新城疫病毒疫苗成本可有效降低。
发明专利
CN201210093071.1
2012-03-31
CN102703487A
2012-10-03
C12N15/66(2006.01)I
黑龙江大学
葛菁萍;高冬妮;宋刚;凌宏志;平文祥;楼庄伟;唐晓艳;金丽颖;安琪;叶磊
150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号
哈尔滨市松花江专利商标事务所 23109
金永焕
黑龙江;23
HA?NDV?F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于HA?NDV?F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：一、以质粒pNDV?F?T为模板，YL1和YL2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与pMD18?T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒pTYL?HA?F，然后用限制性内切酶Xho?I和Sal?I双酶切pTYL?HA?F，获得HA?F片段；二、质粒pLM、pLM?ITRs、pLM(?)、pSD、pSD?ITRs、pSD(?)分别进行Sal?I单酶切，酶切后获得线性载体质粒pLM、pLM?ITRs、pLM(?)、pSD、pSD?ITRs、pSD(?)，然后在分别进行去磷酸化处理，获得去磷酸化后线性片段pLM、pLM?ITRs、pLM(?)、pSD、pSD?ITRs、pSD(?)，再用PCR纯化试剂盒进行纯化；三、用T4连接酶将HA?F片段与去磷酸化后线性片段pLM、pLM?ITRs、pLM(?)、pSD、pSD?ITRs、pSD(?)分别进行连接，六种连接产物经鉴定后获得六种重组转移载体，分别为pYL?LM、pYL?LM?ITRs、pYL?LM(?)、pYL?SD、pYL?SD?ITRs和pYL?SD(?)；四、将六种重组转移载体分别转化E.coli?DH10?Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid?DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid?YL；五、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid?YL转染sf9细胞，获得六种重组杆状病毒vYL?LM、vYL?LM?ITRs、vYL?LM(?)、vYL?SD、vYL?SD?ITRs和vYL?SD，即完成HA?NDV?F基因重组杆状病毒表达载体的构建；其中步骤一中引物YL1序列为5’?ATATCGATATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGGCTCCAGACCTTCTACCAAGA?3’；引物YL2序列为5’?CGGGTCGACTCACATTTTTGTAGTGGCTCTCATCTGATC?3’。