HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法
HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前杆状病毒介导的外源基因在CHO细胞中的表达率较低的问题。方法：一、以pMD18-T-VP2为模板进行PCR扩增，获得目的片段进行TA克隆及载体连接，得pTZF-HA-VP2；二、九种质粒和pTZF-HA-VP2分别进行双酶切，酶切后的目的片段进行连接，得九种重组转移载体；三、九种重组转移载体分别转化感受态细胞，经提取后得rBac-TZF-X；四、rBac-TZF-X转染sf9细胞，得rBV-TZF-X即完成。本发明添加调控元件WPRE可以提高杆状病毒介导外源基因在CHO细胞中的表达率。
发明专利
CN201210093043.X
2012-03-31
CN102618579A
2012-08-01
C12N15/866(2006.01)I
黑龙江大学
葛菁萍;高冬妮;宋刚;凌宏志;平文祥;楼庄伟;唐晓艳;金丽颖;安琪;田兆峰
150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号
哈尔滨市松花江专利商标事务所 23109
金永焕
黑龙江;23
HA?VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于HA?VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：一、以质粒pMD18?T?VP2为模板，TZF?1和TZF?2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与pMD18?T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒pTZF?HA?VP2；二、质粒pWK、pWK?I、pLM、pLM?I、pSD、pSD?I、pWKC、pLMC、pSDC和pTZF?HA?VP2分别进行EcoR?I/Sal?I双酶切，酶切后获得的目的片段pWK、pWK?I、pLM、pLM?I、pSD、pSD?I、pWKC、pLMC、pSDC分别与酶切后的pTZF?HA?VP2用T4DNA连接酶进行连接，九种连接产物经鉴定后获得九种重组转移载体，分别为pTZF?WK?HA?VP2、pTZF?WK?I?HA?VP2、pTZF?LM?HA?VP2、pTZF?LM?I?HA?VP2、pTZF?SD?HA?VP2、pTZF?SD?I?HA?VP2、pTZF?WKC?HA?VP2、pTZF?LMC?HA?VP2和pTZF?SDC?HA?VP2；三、将九种重组转移载体分别转化E.coli?DH10?Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid?DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒rBac?TZF?X；四、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒rBac?TZF?X转染sf9细胞，获得九种重组杆状病毒rBV?TZF?X，分别为rBV?TZF?WK?HVP2、rBV?TZF?WK?I?HVP2、rBV?TZF?LM?HVP2、rBV?TZF?LM?I?HVP2、rBV?TZF?SD?HVP2、rBV?TZF?SD?I?HVP2、rBV?TZF?WKC?HVP2、rBV?TZF?LMC?HVP2和rBV?TZF?SDC?HVP2，即完成HA?VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建；其中步骤一中引物TZF?1序列为5’?CCGGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC?3’；引物TZF?2序列为5’CGCGTCGACTTACCTTATGGCCCGGATTATGTCTTT?3’。