EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法
EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。是要解决目前重组杆状病毒质粒载体转导效率低、表达效率较工业生产要求差距大、表达时间短等问题。方法；一、PCR扩增EF1α基因；二、构建质粒pT-EF1α；三、构建质粒pWK；四、PCR扩增L-ITR基因，构建pWK-L-ITR；五、PCR扩增R-ITR基因，构建pWK-ITR；六、PCR扩增EGFP基因，构建EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP。本发明通过添加VSV-GED、WPRE和ITR元件，增强了外源基因的表达效率，增强了病毒的转导效率，延长了表达时间。
发明专利
CN201210012811.4
2012-01-16
CN102533862A
2012-07-04
C12N15/866(2006.01)I
黑龙江大学
葛菁萍;高冬妮;平文祥;楼庄伟
150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号
哈尔滨市松花江专利商标事务所 23109
韩末洙
黑龙江;23
EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：一、以质粒peglk为模板，WK2和WK3为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EF1α基因；二、将EF1α基因与pMD18?T载体连接，得到质粒pT?EF1α；三、分别对质粒pT?EF1α和pFB?VSVGED?WPRE进行双酶切，将酶切后获得的目的片段EF1α和酶切后的pFB?VSVGED?WPRE连接，得到质粒pWK；四、以pAAV?LacZ为模板，La和Lb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得L?ITR基因，分别对L?ITR基因和pWK进行单酶切，将酶切后的L?ITR和pWK连接，连接产物即为pWK?L?ITR；五、以pAAV?LacZ为模板，Ra和Rb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得R?ITR基因，分别对R?ITR基因和pWK?L?ITR进行单酶切，将酶切后的R?ITR和pWK?L?ITR连接，连接产物即为pWK?ITR；六、以pEGFP?C3为模板，pEGFP?f和pEGFP?r为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EGFP基因，分别对EGFP基因和pWK?ITR进行双酶切，将酶切后的EGFP和pWK?ITR连接，连接产物即为EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK?ITR?EGFP；其中步骤一中PCR扩增所用引物WK2序列为5’?TGCTCTAGACGTGAGGCTCCGGTGCCC?3’，引物WK3序列为5’?CCGGAATTCCGGCGGCCGCTGATCGATTCACGACACCTGAAATGGAAGAAAAAA?3’；步骤四中PCR扩增所用引物La序列为5’?TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT?3’，引物Lb序列为5’?TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG?3’；步骤五中PCR扩增所用引物Ra序列为5’?ATACGGTCCGATGTCTGGATCTCCGGACACGTG?3’，引物Rb序列为5’?ATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGGCG?3’；步骤六中PCR扩增所用引物pEGFP?f序列为5’?ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG?3’，引物pEGFP?r序列为5’?TCAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC?3’。