AMF群落多样性巢式PCR-DGGE检测中DNA Marker的制备方法
本发明公开一种AMF群落多样性巢式PCR-DGGE检测中DNA?Marker的制备方法，其技术方案是提取土壤DNA，DGGE分析，克隆转化，验证条带在DGGE胶片上的位置，制作AMF群落多样性巢式PCR-DGGE?Marker，使用NS31-GC和GloI为引物进行PCR扩增，结合序列分析结果并命名使用。本发明在AMF群落结构的Nested?PCR-DGGE研究中有重要的应用价值。可缩短实验时间，尤其适用实验样品量大的实验过程。依照本发明可以开发出一系列研究AMF群落的DNA?Marker，使得巢式PCR-DGGE技术在AMF分子群落研究中更加适用、快捷、准确。
发明专利
CN201010617030.9
2010-12-30
CN102146370A
2011-08-10
C12N15/10(2006.01)I
西北农林科技大学
唐明;张海涵;陈辉
712100 陕西省西安市杨凌示范区邰城路3号（园艺学院）
西安集思得知识产权代理有限公司 61210
张晋吉
陕西;61
AMF群落多样性巢式PCR?DGGE检测中DNA?Marker的制备方法，其特征在于：是通过以下方法实现的：1.a.提取土壤DNA，纯化DNA样品，选用3套引物进行巢式PCR过程，得到的第三次PCR产物之后，?20℃保存备用；1.b.DGGE分析，选择胶浓度30％?70％，等待胶凝固完全之后，拔掉梳子，然后将整个板子安装在DGGE支架之上，等电泳液温度升至58?60℃时，将安装有板子的DGGE支架放入电泳槽中，用50微升注射器快速上样，接通电源，电泳，电泳液温度为58℃，电泳完毕，取下电泳板子，将胶条放入EB中染色10min，拍照，将电泳位置有差异的条带切下，放入无菌的PCR小管中，编号，在无菌操作台中，向PCR小管中加入30μl无菌水，放置温度4℃，24h，使用不含GC夹板的第三对引物再次扩增，得到PCR产物，纯化，回收，?20℃备用；1.c.克隆转化，使用北京天根生化技术有限公司的pGM?T载体进行特异条带的克隆，转化DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，使用NS31和GloI引物进行菌液PCR，利用北京天根生化公司的DP?103质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒，一部分测序，一部分?20℃保存；1.d.再次验证条带在DGGE胶片上的位置，使用NS31?GC和GloI为引物，进行PCR扩增，PCR产物进行DGGE电泳；1.e.制作AMF群落多样性巢式PCR?DGGE?Marker，使用NS31?GC和GloI为引物，进行PCR扩增，PCR产物按照等体积比例充分混合，3000rpm离心1min，?20℃保存待用；1.f.结合序列分析结果，明确AMF群落多样性巢式PCR?DGGE?Marker中每条带所代表的AMF种属，并命名使用。