GSH2基因甲基化定量检测方法
本发明属于生物医学技术领域。基因的异常甲基化参与肿瘤的发生发展，本发明的目的在于克服甲基化敏感性限制性内切酶法、重亚硫酸盐测序法和甲基化特异性PCR法的缺点，提供一种操作简便、敏感性高的GSH2基因甲基化定量检测方法。本发明取胰腺癌组织，提取DNA制备ACTB的标准曲线样品，利用全甲基化模板，制备GSH2的标准曲线样品；提取待测组织DNA，并进行化学修饰，针对人GSH2基因启动子区CPG岛设计甲基化引物及探针，针对人参照基因ACTB启动子区CPG岛设计BSP引物及探针，采用Taqman-MGB实时定量PCR方法对亚硫酸盐处理后的DNA进行实时定量PCR，计算出GSH2基因甲基化程度的定量值。本发明方法快速、准确、灵敏度高。
发明专利
CN201010157486.1
2010-04-27
CN101818203A
2010-09-01
C12Q1/68(2006.01)I
中国人民解放军第二军医大学
李兆申;黄浩杰;高军;杜奕奇;龚燕芳;施新岗;王丽华;顾俊骏;许爱平
200433 上海市翔殷路800号
上海德昭知识产权代理有限公司 31204
丁振英
上海;31
一种GSH2基因甲基化定量检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：A、待检样本处理：用QIAGEN?EpiTect?Bisufite?KitTM试剂盒对待检样本的DNA进行重亚硫酸盐处理，用作扩增模板；B、分别制备ACTB参照基因的标准品和GSH2靶基因的标准品：设计并合成ACTB参照基因的BSP引物：ACTB?BF：5′TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT?3′(SEQ?IDNO：1)ACTB?BR：5′AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA?3′(SEQ?IDNO：2)设计并合成GSH2靶基因的BSP引物：GSH2BF：5′GTTTAAAGGGAGGYGATTAGATAG?3′(SEQ?ID?NO：4)GSH2BR：5′TTCTCTCTCCAACTCCAAAAATTA?3′(SEQ?ID?NO：5)ACTB参照基因进行BSP反应的条件：95℃预变性10min；95℃变性30s.60℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；GSH2靶基因进行BSP反应的条件：95℃预变性10min；95℃变性30s.53.3℃退火30s.72℃延伸30s，共40个循环；PCR产物进行纯化，连接入pMD?18-T?Vector，然后电击法转化至E.coli?DH5α、工程菌，测序正确的重组菌进行扩增，应用试剂盒抽提纯化质粒，分别制备出ACTB参照基因的标准品和GSH2靶基因的标准品；标准品序列如SEQ?ID?NO：6所示。C、在BSP扩增片段上下游设计MSP引物及探针GSH2MF：5′GTTTTCGATGCGTAGGATGC?3′(SEQ?ID?NO：7)GSH2MR：5′ACGTTTTTAACTAAACCTACGCGC?3′(SEQ?ID?NO：8)D、GSH2基因甲基化的定量检测：设计并合成ACTB的探针和GSH2的探针：ACTB探针：FAM-TTTGTTATTGTGTGTTGGGTG-MGBGSH2探针：FAM-ATCCCTCTTTAATCCT-MGB对重亚硫酸盐处理过的待检样本DNA，分别同时进行实时荧光定量PCR、条件是：①95℃10min②95℃15s，70℃15s，60℃1min，共50个循环；检测ACTB和GSH2基因的拷贝数；待检样本DNA中GSH2基因的拷贝数除以ACTB基因的拷贝数，即为待检样本中GSH2基因甲基化程度的定量值。